李鵬飛 陳曉娟 孫誠浩 張文怡 吳安然 管懷進

年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)是主要的致盲性眼病之一。隨著我國人口老齡化的加劇，ARC患者比例會進一步加大，給整個社會和患者家庭造成巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[1]。目前，ARC的病因及發(fā)病機制仍未闡明，因此還沒有靶向治療的有效藥物，現(xiàn)今仍需通過手術(shù)進行治療。研究表明，晶狀體內(nèi)部蛋白質(zhì)的紊亂和錯誤折疊蛋白質(zhì)的異常聚集均能引起晶狀體折射率的改變，造成晶狀體混濁[2]。泛素化修飾是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，是指泛素在一系列酶，如E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶、E3泛素連接酶的催化下共價結(jié)合到底物蛋白(如錯誤折疊蛋白等)的過程[3]。由于E3泛素連接酶能決定底物蛋白的特異性，因此也被公認(rèn)是泛素化過程中最重要的調(diào)控因素。

目前普遍認(rèn)為，晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)的DNA氧化損傷修復(fù)功能障礙是ARC重要的分子病理基礎(chǔ)[4-6]。同時，本課題組經(jīng)研究證實在中波紫外線(UVB)誘導(dǎo)的氧化損傷環(huán)境中，LEC內(nèi)蛋白質(zhì)的泛素化明顯增多，并且在泛素修飾組學(xué)數(shù)據(jù)中顯示多個DNA氧化修復(fù)蛋白存在差異的泛素化修飾[7]。8-氧代鳥嘌呤-DNA糖基化酶(OGG1)是DNA堿基切除修復(fù)途徑的關(guān)鍵蛋白，前期研究已證實其在ARC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[8-10]。然而，OGG1蛋白翻譯后修飾的研究尚未見相關(guān)報道。因此，本研究設(shè)計以人LEC細(xì)胞株SRA01/04作為研究對象，旨在探索OGG1在LEC氧化損傷過程中的泛素化降解機制。

1 材料與方法

1.1 材料SRA01/04細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶和細(xì)胞培養(yǎng)板均購自Gibco公司(美國)，Hanks平衡鹽溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自碧云天生物技術(shù)公司；手持UVB檢測燈購自光豪分析儀器公司；免疫沉淀試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；S期激酶相關(guān)蛋白2(SKP2)過表達質(zhì)粒購自中國PPL質(zhì)粒與蛋白共享庫；GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG二抗均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，OGG1和SKP2抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)取出待復(fù)蘇的SRA01/04細(xì)胞，置于37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)迅速解凍，隨后放入離心機中1000 r·min-1離心10 min。棄上清液后加入新鮮培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10 g·L-1青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基)，接種至培養(yǎng)瓶中。最后，將其置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞密度至80%左右時，用Hanks平衡鹽溶液清洗細(xì)胞，加入PBS，在紫外燈下30 cm處進行照射。細(xì)胞分為UVB組和對照組，而UVB組根據(jù)照射時間不同又分為0 min、10 min、15 min、30 min、45 min照射組。待照射結(jié)束后，換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將SRA01/04細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達60%～70%時進行轉(zhuǎn)染。分組設(shè)為空白對照組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染SKP2過表達質(zhì)粒組。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組6孔板中轉(zhuǎn)染試劑體積比VOpti-MEMVLipofectamine3000VP3000為250 μL75 μL5 μL,再加入2.5 μg轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進行混合，室溫下孵育15 min。之后，放入培養(yǎng)箱中孵育6 h，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，供后續(xù)實驗。再通過UVB照射構(gòu)建損傷模型，分組設(shè)為空白對照組、UVB組、UVB+轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組以及UVB+轉(zhuǎn)染SKP2過表達質(zhì)粒組，后續(xù)檢測目的蛋白表達。

1.5 免疫沉淀實驗根據(jù)實驗要求處理細(xì)胞后，加入免疫沉淀裂解液(20 mmol·L-1Tris-HCl，100 mmol·L-1NaCl，體積分?jǐn)?shù)1% TritonX-100)，提取蛋白質(zhì)上清。IP組分為IgG組、OGG1組、SKP2組，IP組進行免疫沉淀實驗，用OGG1抗體沉下與OGG1結(jié)合的蛋白；用SKP2抗體沉下與SKP2結(jié)合的蛋白；Input組是總蛋白，未經(jīng)免疫沉淀實驗處理的細(xì)胞總蛋白。每組取400 μg蛋白原液，分別加入1 μL 對應(yīng)的抗體后在搖床上孵育過夜。之后根據(jù)說明書，利用磁力架將抗體-蛋白復(fù)合物提取出來，進行蛋白免疫印跡實驗。同時，本實驗的Input組取30 μL蛋白原液以檢測內(nèi)源性或所轉(zhuǎn)染蛋白的表達。實驗重復(fù)3次。

1.6 蛋白免疫印跡實驗檢測各組細(xì)胞中不同因子的蛋白表達將細(xì)胞置于冰上，PBS清洗后加入200 μL蛋白裂解液(CMRIPA比值為1100)冰上裂解；提取蛋白上清后，采用BCA試劑盒檢測蛋白上樣量；凝膠電泳(80 V，120 min)分離蛋白；采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(250 mA，2 h)，隨后將PVDF膜用封閉液室溫封閉2 h；根據(jù)對應(yīng)的抗體說明書配置一抗稀釋液(泛素、OGG1、SKP2稀釋度均為11000；GAPDH稀釋度為16000)，并置于4 ℃冰箱進行孵育過夜。第2天用TBST緩沖液漂洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋度為110 000)，室溫孵育2 h 。最后加入顯影劑，在暗室內(nèi)進行曝光顯影。采用GAPDH作為實驗內(nèi)參，計算目的蛋白表達的灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法本研究采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。不同分組之間的蛋白表達量均采用單因素方差分析，兩樣本間比較采用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LEC中OGG1蛋白的泛素化修飾及其E3泛素連接酶的預(yù)測免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，OGG1存在泛素化修飾(圖1A)。利用UbiBrowser軟件(http://ubibrowser.ncpsb.org.cn/v2/)進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SKP2可能是導(dǎo)致OGG1發(fā)生泛素化修飾的潛在E3泛素連接酶(圖1B)。

圖1 OGG1存在泛素化修飾并預(yù)測其相關(guān)的E3泛素連接酶 A： 免疫沉淀實驗檢測發(fā)現(xiàn)OGG1存在泛素化修飾；B ：UbiBrowser軟件預(yù)測顯示，SKP2可能參與調(diào)控OGG1的泛素化修飾。

2.2 SKP2與OGG1之間相互作用為驗證SKP2能夠與OGG1發(fā)生結(jié)合，通過免疫沉淀實驗檢測出與SKP2相互作用的蛋白，然后利用免疫印跡實驗檢測OGG1蛋白，結(jié)果顯示：SKP2與OGG1存在一定的結(jié)合能力，表明SKP2有可能參與介導(dǎo)OGG1蛋白的泛素化修飾(圖2)。

圖2 免疫沉淀實驗觀察SKP2與OGG1之間的相互作用

2.3 各組SRA01/04細(xì)胞中SKP2蛋白表達變化蛋白免疫印跡實驗檢測SKP2在各組細(xì)胞中表達變化，結(jié)果顯示：在UVB照射10 min時，SKP2蛋白的相對表達量明顯比其他照射時間減少，且與對照組相比也減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。隨著UVB照射時間的遞增，SRA01/04細(xì)胞中SKP2蛋白相對表達量呈劑量依賴性增加。因此，根據(jù)實驗需要后續(xù)實驗細(xì)胞氧化損傷模型均采用UVB照射10 min后孵育24 h。

圖3 細(xì)胞中SKP2蛋白在UVB照射后不同時間的表達變化 免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在UVB照射時間梯度升高時，SKP2蛋白表達先減少后增加，且在照射10 min時表達最低。*P<0.05，****P<0.001,ns:P>0.05。

2.4 SKP2過表達模型驗證蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示：空白對照組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染SKP2過表達質(zhì)粒組細(xì)胞中SKP2蛋白的相對表達量分別為1.040±0.007、0.920±0.008和1.330±0.020；與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染SKP2過表達質(zhì)粒組細(xì)胞中SKP2蛋白的表達顯著上調(diào)(P<0.05)(圖4)，表明SKP2過表達模型構(gòu)建成功。

圖4 SKP2過表達效率的驗證 與空白對照組及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染SKP2過表達質(zhì)粒組細(xì)胞中SKP2蛋白表達顯著增加。

2.5 OGG1蛋白在SKP2過表達模型中的表達變化采用免疫印跡實驗檢測各組細(xì)胞中OGG1的表達情況，結(jié)果顯示，空白對照組、UVB組、UVB+轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組和UVB+轉(zhuǎn)染SKP2過表達質(zhì)粒組中OGG1蛋白的相對表達量分別為1.05±0.01、5.05±0.16、5.20±0.07 和3.83±0.10；與UVB+轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組相比，UVB+轉(zhuǎn)染SKP2過表達質(zhì)粒組SRA01/04細(xì)胞中OGG1蛋白相對表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖5 OGG1蛋白在SKP2過表達模型中的表達變化

3 討論

ARC的發(fā)生發(fā)展過程受多種因素的影響，包括UVB照射和氧化損傷等[11-12]。有研究證實，UVB是ARC發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)境因素之一[5]。LEC通過吸收大量UVB，引起DNA氧化損傷、蛋白質(zhì)翻譯后修飾(如泛素化)、細(xì)胞周期改變等分子水平上的改變，進而導(dǎo)致晶狀體內(nèi)功能蛋白質(zhì)失穩(wěn)發(fā)生錯誤折疊。有研究顯示，在全身老年性(年齡相關(guān)性)疾病、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤中，氧化應(yīng)激(如UVB、自由基等)所致受損的DNA氧化損傷修復(fù)蛋白(如P53、ATM、WRN等)無法及時被泛素化降解時，一方面這些蛋白不僅發(fā)揮不了損傷DNA修復(fù)的作用，同時這些蛋白聚集體還會引起蛋白毒性，干擾多種細(xì)胞過程，最終引起上述疾病的發(fā)生[13-16]。

眾所周知，泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是真核細(xì)胞清除發(fā)生錯誤折疊蛋白的一種重要的降解手段[17]。在前期研究中[7]，我們利用UVB照射LEC細(xì)胞株構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型，通過實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在氧化損傷環(huán)境下，晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)的泛素化水平明顯升高；同時通過整合蛋白組學(xué)和泛素修飾組學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，POLR2B和POLR2L等多個DNA氧化損傷修復(fù)蛋白存在顯著的泛素化修飾，表明UPS在LEC的DNA氧化損傷蛋白質(zhì)量控制中可能發(fā)揮著重要的作用，但其在ARC中的具體調(diào)控機制尚缺乏相關(guān)研究報道。

UPS由E1、E2、E3、去泛素化酶以及蛋白酶體共同組成，其具體的形成過程如下：當(dāng)ATP持續(xù)供能的前提條件下，E1能夠結(jié)合泛素C端的Cys殘基并激活泛素；而活化后的泛素則由E1轉(zhuǎn)移至E2形成名為E2-泛素巰基酯的中間產(chǎn)物；隨后E2和不同類型的E3共同識別底物蛋白，形成泛素化修飾；最后泛素化修飾的蛋白被26 S蛋白酶體識別并降解。在泛素化降解的過程中，E3因能夠識別底物和招募E2，而對蛋白質(zhì)的泛素化修飾起到關(guān)鍵調(diào)控作用。目前已鑒定出的E3有600余種，根據(jù)其特征性結(jié)構(gòu)域和介導(dǎo)泛素連接至底物機制的不同，將E3分為3大類：RING E3s、HECT E3s以及RBP E3s[4]，其中RING E3s是最常見的一類泛素連接酶。而SCF(SKP1-Cull-F-box)是RING E3s泛素連接酶中最大的一個家族；已知SKP2是SCF降解體系中關(guān)鍵一員，起到識別底物的功能[18]。本研究發(fā)現(xiàn)：在體外構(gòu)建的LEC氧化損傷模型中，細(xì)胞中SKP2的表達水平在損傷初期(10 min)呈下降趨勢，隨著UVB照射時間的延長，細(xì)胞內(nèi)待泛素化降解的蛋白不斷累積，其表達水平也逐漸升高，說明SKP2在LEC的氧化損傷過程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)， SKP2通過靶向降解DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白(如P27、P21、P57和Foxo1等)影響細(xì)胞周期的進程，從而發(fā)揮抑癌的功能[19-22]。在本研究中，我們首先通過免疫沉淀實驗確定OGG1蛋白存在泛素化修飾。OGG1是DNA堿基切除修復(fù)通路途徑的重要蛋白之一[23]。本課題組前期研究中已發(fā)現(xiàn)在早期輕度三種類型ARC患者樣本中OGG1的mRNA和蛋白表達均顯著升高[9]，但影響其蛋白表達改變的具體調(diào)控機制尚未見相關(guān)報道。因此，本研究利用軟件預(yù)測了可能與OGG1蛋白發(fā)生結(jié)合的E3泛素連接酶，并采用免疫沉淀實驗驗證發(fā)現(xiàn)SKP2與OGG1之間能夠發(fā)生相互作用。此外，結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)，OGG1蛋白的表達在LEC氧化損傷過程中與SKP2蛋白呈相反的表達趨勢，揭示了早期ARC發(fā)生過程中的OGG1蛋白應(yīng)激性升高的潛在原因。因此，為了進一步探討SKP2對OGG1表達的影響，本研究轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒增加了SKP2蛋白的表達觀察OGG1的表達，結(jié)果顯示，氧化損傷早期當(dāng)細(xì)胞內(nèi)SKP2蛋白的表達升高時，OGG1蛋白的表達隨之下降，進而影響LEC內(nèi)損傷DNA的修復(fù)過程，導(dǎo)致ARC的發(fā)生。

綜上所述，E3泛素連接酶SKP2在UVB誘導(dǎo)的早期LEC氧化損傷模型中表達減少，并隨著照射時間和損傷的累積而逐漸增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，SKP2能夠介導(dǎo)DNA氧化損傷修復(fù)蛋白OGG1發(fā)生泛素化修飾，通過調(diào)控OGG1蛋白的表達進而影響損傷DNA的修復(fù)過程，參與ARC的發(fā)生發(fā)展。