何 靜 謝 平 歐陽君 肖婷婷 徐琰瑛 袁 晴

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥之一[1-2]，其主要病理特征包括視網(wǎng)膜微血管生成和視網(wǎng)膜脫落[3]。因此，抑制長期高糖誘導的新生血管生成和人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(HRMEC)增殖十分重要。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在DR大鼠模型的視網(wǎng)膜組織和血清中的表達均發(fā)生失調(diào)[4]，提示miR-146a可能是與DR發(fā)病機制有關(guān)的重要因子。目前，人們對miR-146a在視網(wǎng)膜細胞中的作用及其潛在的分子機制仍然不太清楚。白細胞介素(IL)-17是一種多效性促炎性細胞因子，其家族成員IL-17A能夠通過損傷視網(wǎng)膜Müller細胞功能加重DR病變進程[5]。因此，阻斷IL-17A是一種潛在的DR治療策略。人IL-17A mRNA 3’端與miR-146a具有一定的同源性，這表明IL-17A可能是miR-146a的潛在靶點。本研究探討miR-146a對高糖誘導的HRMEC增殖和新生血管生成的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器HRMEC(美國Angio-Proteomie微生物菌種保藏中心)，miR-146a mimics及其相應(yīng)的陰性對照品(中國南通生物科技有限公司)，OligofectamineTM轉(zhuǎn)染試劑和pcDNA3.1質(zhì)粒(美國Invitrogen公司)，鼠抗人Ki-67核抗體(中國武漢Proteintech公司)，免疫印跡一抗(小鼠抗人多克隆抗體)VEGF、VEGF受體2(VEGFR2)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和磷酸化AKT(p-AKT)(美國ABGENT公司)。ABI Prism 7700型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組將HRMEC放入含體積分數(shù)5%胎牛血清、0.1 U·L-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中，置于37 ℃體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細胞進行處理，使用OligofectamineTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染50 nmol·L-1miR-146a mimics序列或miR-NC陰性對照序列。此外，將IL-17A全長插入pcDNA3.1質(zhì)粒中，同樣使用OligofectamineTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染20 nmol·L-1pcDNA3.1-IL-17A質(zhì)粒或pcDNA3.1空質(zhì)粒。將細胞分為正常組、高滲組、高糖組、陰性對照組、miR-146a mimics組、miR-146a mimics+IL-17A組。正常組細胞用含5.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，高滲組細胞用含5.5 mmol·L-1D-葡萄糖和50 mmol·L-1甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；其余各組細胞先用含30 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,陰性對照組、miR-146a mimics組、miR-146a mimics+IL-17A組分別轉(zhuǎn)染陰性對照序列+pcDNA3.1空質(zhì)粒、miR-146a mimics質(zhì)粒、miR-146a mimics+pcDNA3.1-IL-17A質(zhì)粒。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力將HRMEC接種在96孔板中分組處理，加入MTT試劑后靜置4 h，棄上清，將形成的紫色晶體溶于DMSO中，用酶標儀檢測光密度(D490)，計算各組細胞活力。

1.2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移活性將HRMEC接種在24孔培養(yǎng)板中，分組處理后加入1 mg·L-1的絲裂霉素C孵育1 h，用黃色移液槍頭尖在細胞表面均勻劃一橫線。清洗細胞碎片，分別于劃傷后0 h、24 h時測量劃痕距離，計算各組細胞遷移率。

1.2.4 Matrigel法檢測細胞管腔形成情況將HRMEC接種于Matrigel基質(zhì)膠表面，分組處理后，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及管狀結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.5 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達將HRMEC分組處理后，提取約10×106個細胞內(nèi)總蛋白并測定蛋白濃度，垂直電泳分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，用0.5 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗(稀釋比為11000)孵育過夜，次日加入羊抗兔IgG室溫孵育2 h；用ECL化學發(fā)光法進行檢測，以GAPDH作為參照計算蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析和兩樣本獨立t檢驗進行組間比較。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組HRMEC細胞活力高滲組細胞活力與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而高糖組、陰性對照組細胞活力均高于正常組(均為P<0.05)；與高糖組和陰性對照組相比，miR-146a mimics組細胞活力均降低(均為P<0.05)；miR-146a mimics+IL-17A組細胞活力則高于miR-146a mimics組(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組HRMEC細胞活力 A：正常組；B：高滲組；C：高糖組；D：陰性對照組；E：miR-146a mimics組；F：miR-146a mimics+IL-17A組。與正常組相比，aP<0.05；與高滲組相比，bP<0.05；與高糖組相比，cP<0.05；與陰性對照組相比，dP<0.05；與miR-146a mimics組相比，eP<0.05。

2.2 各組HRMEC細胞遷移能力高滲組細胞遷移率與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而高糖組、陰性對照組細胞遷移率均高于正常組(均為P<0.05)；與高糖組和陰性對照組相比，miR-146a mimics組細胞遷移率均降低(均為P<0.05)；miR-146a mimics+IL-17A組細胞遷移率則較miR-146a mimics組升高(P<0.05)(圖2)。

圖2 各組HRMEC細胞遷移率 A：正常組；B：高滲組；C：高糖組；D：陰性對照組；E：miR-146a mimics組；F：miR-146a mimics+IL-17A組。與正常組相比，aP<0.05；與高滲組相比，bP<0.05；與高糖組相比，cP<0.05；與陰性對照組相比，dP<0.05；與miR-146a mimics組相比，eP<0.05。

2.3 各組HRMEC管腔形成情況高滲組細胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而高糖組、陰性對照組細胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量均高于正常組(均為P<0.05)；與高糖組和陰性對照組相比，miR-146a mimics組細胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量均降低(均為P<0.05)； miR-146a mimics+IL-17A組細胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量則較miR-146a mimics組升高(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組HRMEC環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量 A：正常組；B：高滲組；C：高糖組；D：陰性對照組；E：miR-146a mimics組；F：miR-146a mimics+IL-17A組。與正常組相比，aP<0.05；與高滲組相比，bP<0.05；與高糖組相比，cP<0.05；與陰性對照組相比，dP<0.05；與miR-146a mimics組相比，eP<0.05。

2.4 各組HRMEC中血管形成相關(guān)蛋白和PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的表達情況高滲組HRMEC中VEGF、VEGFR2、IL-17A、p-PI3K、p-AKT蛋白相對表達量與正常組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；而高糖組、陰性對照組上述蛋白相對表達量均高于正常組(均為P<0.05)；miR-146a mimics組上述蛋白相對表達量均低于高糖組(均為P<0.05)； miR-146a mimics+IL-17A組上述蛋白相對表達量均高于miR-146a mimics組(均為P<0.05)(圖4)。

圖4 各組HRMEC相關(guān)蛋白Western blot檢測結(jié)果 A：正常組；B：高滲組；C：高糖組；D：陰性對照組；E：miR-146a mimics組；F：miR-146a mimics+IL-17A組。

3 討論

DR是眼科常見的致盲性眼病之一[6]，抑制高糖引起的微血管生成對抑制DR的發(fā)展至關(guān)重要[7]。近年來，有關(guān)miRNAs的研究成果為我們對復雜生物學機制的理解提供了新的思路[8-9]。持續(xù)高糖環(huán)境下HRMEC的異常增殖和微血管生成是DR的典型病理特征[10]。在本研究中，HRMEC暴露于高糖環(huán)境下導致細胞活力明顯增加，miR-146a表達下調(diào)，同時VEGF和VEGFR2蛋白表達明顯上調(diào)，PI3K/AKT信號通路被激活。這說明高糖能促進HRMEC增殖以及新生血管生成。本研究中HRMEC轉(zhuǎn)染miR-146a mimics 后miR-146a表達上調(diào)，這可抑制高糖誘導的細胞過度增殖和新生血管生成，同時也可逆轉(zhuǎn)高糖誘導的IL-17A表達升高，對于PI3K/AKT途徑的激活也有抑制作用。

miR-146a是與炎癥、先天性免疫疾病和癌癥有關(guān)的miRNAs，其在不同類型的視網(wǎng)膜細胞中有不同程度的表達[11]。周垂仁等[12]研究證實，DR患者血清miR-146a含量明顯降低，同時VEGF含量明顯增加。因此，miR-146a有可能通過介導炎癥反應(yīng)和新生血管生成參與DR的發(fā)病過程。而上調(diào)大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞中miR-146a的表達則可抑制高糖誘導的炎癥通路的激活，從而減輕或延緩視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞損傷及神經(jīng)元功能缺陷[13-15]，這與本研究結(jié)論基本一致。此外，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-146可降低高糖誘導的IL-17A表達以及HRMEC細胞活力，提示IL-17A可能是miR-146a調(diào)控的重要靶點。這一點通過生物信息學檢索和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炓驳玫搅俗C實。IL-17A是一種重要的促炎細胞因子，高糖環(huán)境可誘導HRMEC中IL-17A表達顯著上調(diào)[16]，而抑制IL-17A表達則對增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞有一定的保護作用[17]。因此，miR-146對下游IL-17A表達的抑制作用可能是影響高糖誘導HRMEC增殖和新生血管生成的重要機制之一。此外，PI3K/AKT通路是一個眾所周知的經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導通路，涉及細胞生長、增殖、運動、存活和凋亡[18]。該途徑的異常激活不僅可導致多種惡性腫瘤細胞的存活和增殖[19]，也與高糖刺激有關(guān)；而抑制這些通路被認為是治療增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變的一種有效策略[20]。本研究中，miR-146a mimics+IL-17A組HRMEC中PI3K和AKT蛋白磷酸化水平升高，同時IL-17A過度激活。因此，下調(diào)IL-17A表達，可抑制PI3K/AKT通路激活，進而降低高糖誘導的HRMEC增殖和新生血管生成。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，miR-146a可能在DR進程中扮演著關(guān)鍵角色。高糖可誘導HRMEC中miR-146a表達下調(diào)，而上調(diào)miR-146a表達可有效地降低高糖誘導的HRMEC增殖和新生血管生成。這些作用可能是通過降低IL-17A表達進而抑制PI3K/AKT通路激活所實現(xiàn)的，它是miR-146a發(fā)揮生物學作用的重要機制之一。