楊根嶺 胡榮靜 李金艷△

（1.重慶醫(yī)科大學，重慶 400016；2.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

妊娠期糖尿病（GDM）是一種常見妊娠期并發(fā)癥［1］，GDM時妊娠不良結(jié)局增加［2］。胰島素治療GDM時會引起胰島素敏感性降低［3］。細胞攝取葡萄糖是維持正常血糖的關(guān)鍵步驟，膜蛋白（GLUT）轉(zhuǎn)運葡萄糖到細胞質(zhì)是完成胰島素信號通路的最終步驟［4］。葛根素（Puerarin）是從葛根中提取出的最主要異黃酮類物質(zhì)［5］，能改善高血糖導致的機體發(fā)生的病理改變，具有良好的降糖效果［6］。許多口服降糖藥物對胎兒有致畸作用［7］。目前，國外尚未開展葛根素治療GDM方面的研究，國內(nèi)有少數(shù)學者將葛根素應用于臨床治療GDM。該試驗研究葛根素對GDM的降糖效果，并探討葛根素在治療GDM時的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 PF級SD大鼠雌性50只，雄性20只，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（渝）2018-0003。

1.2 試藥與儀器 葛根素注射液，購自山東方明藥業(yè)集團股份有限公司，批號20111071，規(guī)格為0.1 g/支。儀器：光學顯微鏡（日本Nikon公司），歐姆龍HEA-214血糖儀，酶標儀（ThermoFisher）。

1.3 模型制備 SD大鼠尾靜脈采血測定雌鼠空腹血糖，若血糖大于7.1 mmol/L，予以剔除。動物合籠，次日陰道涂片確定妊娠后按35 mg/kg腹腔注射2%鏈脲菌素（STZ）。檢測血糖≥13.8 mmol/L視妊娠期糖尿病SD大鼠造模成功。

1.4 分組與給藥 將成模大鼠隨機分為葛根素組與糖尿病組，正常妊娠SD大鼠作為對照（正常妊娠組），每組各10只。建模成功后4～20 d，葛根素組每天給予150 mg/kg葛根素灌胃治療［8］，糖尿病組與正常妊娠組灌胃等量生理鹽水。

1.5 觀察指標 每天檢測孕鼠的血糖，妊娠1、11、20 d測體質(zhì)量，妊娠20 d剖宮取胎鼠，記錄胎鼠的數(shù)量、畸形發(fā)生數(shù)。

1.6 標本采集與檢測 1）胰島素及血脂水平檢測。在20 d眶靜脈采血，經(jīng)離心后收集血漿。采用ELISA試劑盒檢測血漿胰島素水平。BS800-2邁瑞全自動生化分析儀測定血清中高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TAG）的含量。2）胰島素病理學觀察。HE染色：在G20.5乙醚麻醉下行剖宮產(chǎn)術(shù)，取孕鼠胰腺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片。胰腺組織切片經(jīng)脫蠟、覆水、蘇木精染色、返藍、鹽酸酒精分化、伊紅復染、脫水、透明、封片，鏡檢。3）胰腺GLUT-4蛋白表達。胰腺組織切片經(jīng)脫蠟復水，抗原修復，去除內(nèi)源性過氧化氫酶，血清封閉，加GLUT-4（濃度為1∶100）過夜，加抗兔生物素化二抗，顯色。蘇木素復染，鹽酸酒精分化，飽和碳酸鋰返藍，脫水、透明、封片、鏡檢。4）Western blotting檢測GLUT-4蛋白表達。提取胰腺組織蛋白，經(jīng)電泳分離、電轉(zhuǎn)至PVDF膜、封閉PVDF膜、分別孵育GLUT-4、β-actin一抗（1∶1 000）4℃過夜，孵育二抗，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)軟件成像及分析目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以（）表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組孕鼠隨機血糖水平比較 見表1。糖尿病組與葛根素組孕鼠的血糖顯著高于正常妊娠組，有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。葛根素不能將孕鼠的血糖完全降至正常，但隨著給藥時間的延長，降糖效果逐漸明顯，在7 d后葛根素組血糖明顯低于糖尿病組（P＜0.05）。

表1 各組孕鼠隨機血糖水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組孕鼠隨機血糖水平比較（mmol/L，±s）

注：與糖尿病組比較，*P＜0.05；與正常妊娠組比較，△P＜0.05。下同。

組別正常妊娠組糖尿病組葛根素組n 10 10 10 1 d 4.30±0.60 4.61±0.58 4.80±0.41 4d 4.50±0.70 26.23±2.83△27.50±3.03△7d 4.40±0.90 27.62±3.66△24.30±5.36*△10d 4.60±0.80 26.82±4.59△18.42±4.72*△13d 4.80±0.60 28.43±5.61△15.48±5.26*△16d 4.90±0.80 31.52±3.68△13.20±4.96*△19d 5.20±0.80 32.96±3.97△10.83±3.76*△

2.2 各組孕鼠血脂和胰島素水平比較 見表2。與正常妊娠組比較，糖尿病組孕鼠的胰島素水平下降、血脂顯著增加（P＜0.05），給予葛根素治療后，胰島素水平顯著增加、血脂水平顯著降低，葛根素組與糖尿病組比較差異顯著（P＜0.05）。葛根素組的胰島素水平較糖尿病組顯著升高，但顯著低于正常妊娠組（P＜0.05），血脂水平顯著低于正常妊娠組（P＜0.05）。

表2 兩組各組孕鼠血脂和胰島素水平比較（±s）

表2 兩組各組孕鼠血脂和胰島素水平比較（±s）

組 別n TC（mmol/L）TAG（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）INS（mU/L）10 10 10正常妊娠組糖尿病組葛根素組1.91±0.42 5.43±1.56△3.32±1.25*△0.86±0.25 3.86±0.91△2.33±0.32*△2.48±0.43 5.01±0.81△3.25±0.57*△0.36±0.12 1.86±0.49△0.68±0.31*△16.38±3.16 9.36±1.48△13.20±4.52*△

2.3 各組孕鼠不同妊娠天數(shù)體質(zhì)量比較 見表3。隨著孕周的增加各組大鼠體質(zhì)量均呈上升趨勢。與正常妊娠組孕中期（11 d）與孕晚期（20 d）體質(zhì)量相比較，糖尿病組孕鼠體質(zhì)量均顯著增加（P＜0.05）；葛根素組孕鼠體質(zhì)量均無顯著差異（P＞0.05）。與糖尿病組孕中期（11 d）與孕晚期（20 d）孕鼠體質(zhì)量相比較，葛根素組體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組孕鼠不同妊娠天數(shù)體質(zhì)量比較（g，±s）

表3 各組孕鼠不同妊娠天數(shù)體質(zhì)量比較（g，±s）

組 別n 妊娠1 d 妊娠11 d 妊娠20 d 234.1±12.3 236.6±13.2 230.1±18.4正常妊娠組糖尿病組葛根素組10 10 10 246.3±16.8 274.6±18.6△255.3±19.4*296.9±22.3 355.8±24.6△319.6±16.2*

2.4 各組胎仔數(shù)、胎鼠體質(zhì)量、胎鼠血糖的比較 見表4。各組胎鼠均未發(fā)現(xiàn)有畸形發(fā)生。與正常妊娠組比較，糖尿病組與葛根素組胎仔數(shù)量顯著減少，胎鼠體質(zhì)量與血糖水平顯著增加（P＜0.05）。與糖尿病組比較，葛根素組胎仔數(shù)顯著增加，胎鼠體質(zhì)量顯著增加，胎鼠血糖顯著降低（P＜0.05）。

表4 各組胎仔數(shù)、胎鼠體質(zhì)量及血糖比較（±s）

表4 各組胎仔數(shù)、胎鼠體質(zhì)量及血糖比較（±s）

組別正常妊娠組糖尿病組葛根素組n 10 10 10胎仔數(shù)（個）12.70±1.49 8.10±1.96△10.80±2.56*體質(zhì)量（g）1.92±0.25 2.94±0.41△2.23±0.37*隨機血糖（mmol/L）3.84±1.53 29.57±1.49△12.83±4.23*△

2.5 各組孕鼠胰腺組織病理學觀察 正常妊娠組孕鼠胰腺胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胰島內(nèi)的胰島細胞排列均勻。糖尿病組胰島萎縮，數(shù)量減少，體積變小，形狀不規(guī)則，胰島細胞呈蟲噬狀。葛根素組胰島數(shù)量和體積均明顯恢復，胰島內(nèi)胰島細胞增多、纖維組織減少。見圖1。

2.6 各組孕鼠胰腺組織GLUT-4免疫組化表達比較 GLUT-4主要表達在胰腺的胰島內(nèi)。鏡下觀察到，糖尿病組僅有少量的胰島細胞染色為棕黃色，GLUT-4表達明顯減少，低于正常妊娠組；經(jīng)葛根素治療后，胰島的GLUT-4的表達明顯增加，高于模型組。見圖2。

2.7 各組孕鼠胰腺組織GLUT-4的表達水平 經(jīng)Western blotting檢測糖尿病組胰腺組織中GLUT-4蛋白相對表達量明顯低于正常妊娠組（P＜0.05），葛根素組表達量明顯升高，但仍然低于正常妊娠組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組GLUT-4蛋白在胰腺組織的表達

3 討 論

GDM是產(chǎn)科常見的并發(fā)癥，在妊娠晚期容易出現(xiàn)急性羊水過多、胎盤早剝等急癥［9］；新生兒容易出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征、死亡等急癥。盡管胰島素是治療GDM的一線藥物，但易出現(xiàn)低血糖等急癥。中藥在治療許多疾病上有獨特的作用［10］，為更好治療妊娠期糖尿病，提高母兒預后，本研究重點研究葛根素應用于治療GDM的效果及作用機制。

葛根素是天然異黃酮，現(xiàn)代醫(yī)藥已將其用于治療糖尿病［6］。葛根素能改善高血糖導致的機體發(fā)生的病理改變，能促進處于高糖環(huán)境的前脂肪細胞對葡萄糖的攝取并呈劑量依賴性［11］。國內(nèi)部分學者應用葛根素治療GDM，降糖效果理想［12］，安全性高［13］，能降低胎兒臍動脈S/D值［14］，降低新生兒生長受限等并發(fā)癥［15］。

妊娠時激素水平升高，胰島素敏感性下降，出現(xiàn)胰島素抵抗，導致GDM發(fā)生［16］。葛根素具有抗糖尿病的特性。葛根素能降低STZ誘導后小鼠糖尿病的發(fā)生，同時增加胰島β細胞的數(shù)量，進一步增加胰島素水平，降低血糖［17］。本研究發(fā)現(xiàn)GDM大鼠胰島受到破壞后，胰島素的生成急劇降低，而使用葛根素治療后胰腺的胰島細胞得以修復，胰島細胞數(shù)量增加，胰島體積變大，胰島內(nèi)纖維化明顯緩解。葛根素對破壞的胰島具有保護作用，并能進一步促進胰島分泌胰島素，該結(jié)果與國內(nèi)外研究葛根素在治療糖尿病時對胰島的作用是一致的。同時研究發(fā)現(xiàn)葛根素在治療GDM時，不能將胰島素、血糖、血脂水平恢復至完全正常，但葛根素治療GDM時能降低孕鼠及胎鼠的血糖水平，并能有效阻止血脂的升高，降低血脂水平，改善GDM孕鼠的代謝能力，能減少孕鼠和胎鼠體質(zhì)量的增加，將孕鼠及胎鼠體重恢復至正常。同時葛根素能減少孕鼠的流產(chǎn)率，增加胎仔數(shù)，推測葛根素在胚胎著床時具有較強的保護作用。

GLUT有多種亞型，其中GLUT-1、GLUT-4對葡萄糖轉(zhuǎn)運尤為重要［18］。GLUT-4在脂肪組織、心肌和胎盤組織中均有表達［19］。90%GLUT4位于細胞內(nèi)；血糖增高時，GLUT4儲存囊泡吸收葡萄糖向質(zhì)膜、骨骼肌細胞的肌膜和T管進行胞吐，參與葡萄糖轉(zhuǎn)運功能［4］。提高GLUT-4表達和刺激GLUT-4囊泡向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運能促進葡萄糖轉(zhuǎn)運［20］。本研究顯示GLUT-4蛋白水平在GDM患者胰腺組織中明顯減少，可能導致葡萄糖的攝取和利用出現(xiàn)障礙，進而不能維持正常的血糖水平；而使用葛根素治療后GLUT-4蛋白的表達顯著提高，表明其能促進葡萄糖的攝取和利用，具有降糖的作用。

該研究表明在治療GDM時，葛根素對胰腺β細胞具有保護作用能恢復胰島的數(shù)量，促進胰島素的分泌；促進胰島上GLUT-4的表達，促進葡萄糖的攝取和利用，從而降低血糖水平。葛根素能減少流產(chǎn)的發(fā)生，降低孕鼠及胎鼠的體質(zhì)量，改善妊娠的結(jié)局。因葛根素不能將GDM血糖降至完全正常，但是其具有保護胰腺、促進胰島素分泌作用，在治療GDM時加用葛根素能取得更好的臨床治療效果。該課題為葛根素的使用提供實驗室依據(jù)并能更好地指導中醫(yī)師使用葛根素治療臨床疾病，開發(fā)葛根素臨床治療的新領(lǐng)域。