萬國盛，蘭公劍，王 恩，陳 栩，林 萍，徐 丹

（南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046）

1-（4-氨基苯基）-5,6-二氫-3-（4-嗎啉基）-2（1H）-吡啶酮（以下稱SM1） 是一種吡啶酮類化合物，是重要的醫(yī)藥中間體[1]，主要用于化學藥物阿哌沙班的合成。而SM1 主要是以4-硝基苯胺（化合物1）為原料經(jīng)酰化等5 個步驟合成（見圖1），合成過程中雖有除雜精制工序，但化合物1 以及各中間體（化合物2、3、4、5）均有進一步微量殘留至SM1 中的可能，應控制其在SM1 中的殘留量，進而控制其以原型或結構類似的傳導雜質的形式傳遞到藥品中的風險，根據(jù)化學藥物研究的相關文獻和指導原則[2-4]，將本品中各雜質的限度制定為0.015%，并建立了可靠的分析方法。

圖1 SM1 的合成路線Fig.1 Synthetic route of SM1

1 實驗部分

1.1 試藥

SM1（批號：268-5-181015-01、268-5-181017-07）；化合物1 對照品（批號：268-SM-181019-01，含量：99.86%）；化合物2 對照品（批號：268-1-892-7，含量：98.67%）；化合物3 對照品（批號：268-2-892-9A，含量：97.86%）；化合物4 對照品（批號：268-3-1689-59C，含量：98.00%）；化合物5 對照品（批號：268-4-828-53，含量：98.27%），上述試藥生產(chǎn)商均為Vcare Pharmatech Co., Ltd.。

1.2 儀器與試劑

Waters Arc 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司，配置Empower3 工作站）；METTLER TOLEDO XS204 型電子天平、METTLER TOLEDO XP205DR型電子天平、METTLER TOLEDO ME802E 型電子天平，梅特勒-托利多公司。

甲醇（色譜純 美國TEDIA 公司）；NH4Ac（色譜純 美國ROE 公司）；實驗用水為默克Millipore 超純水儀自制超純水。

1.3 色譜條件

采用Waters SunFire C18（150mm×4.6mm，3.5μm）色譜柱，流動相A 為0.03mol·L-1乙酸銨緩沖液（取乙酸銨2.31g，加水至1000mL 使溶解，搖勻）-甲醇（75∶25），流動相B 為0.03mol·L-1乙酸銨緩沖液（取乙酸銨2.31g，加水至1000mL 使溶解，搖勻）-甲醇（25∶75），梯度洗脫：0～35min，A 100%～0%；35～40min，A 0%；40～40.1min，A0%～100%；40.1～45min，A 100%，流速為1.0mL·min-1，檢測波長320nm，柱溫35℃。

1.4 溶液的制備

溶劑 甲醇-水（50∶50）。

供試品溶液的制備 取SM1 約200mg，精密稱定，置50mL 量瓶中，加溶劑適量，超聲使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

對照品混合貯備液 分別取化合物1～5 對照品各約3mg，精密稱定，置于同一100mL 量瓶中，加溶劑適量，超聲溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

對照品溶液的制備 精密量取上述對照品混合貯備液適量，用溶劑定量稀釋制成每1mL 中約含各雜質0.6μg 的溶液。

加標供試品溶液 取SM1 和化合物1～5 對照品各適量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1mL 中含SM1 約4mg、化合物1～5 各約0.6μg 的溶液。

系統(tǒng)適用性要求 加標供試品溶液各化合物色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應不小于1.5。

2 結果與討論

2.1 專屬性試驗

在建立的色譜條件下空白溶劑對檢測無干擾，各待測化合物色譜峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，方法專屬性良好，圖2 為系統(tǒng)適用性溶液色譜圖。

圖2 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of system suitability solution

2.2 檢測限和定量限

根據(jù)ICH 指導原則Q2（R1）中信噪比（S/N）法分別確定本品的檢測限（LOD）和定量限（LOQ），按S/N約為3∶1 確定檢測限濃度，按S/N 約為10∶1 確定定量限濃度。取化合物1～5 對照品各適量，用溶劑逐級稀釋，在建立的色譜條件下進樣分析，并將定量限溶液平行配制6 份分別測試，考察保留時間的RSD 和峰面積的RSD，確認方法在檢測限濃度下的精密度。最終測得化合物1 的檢測限和定量限分別為37.90ng·mL-1和76.67ng·mL-1，化合物2 的檢測限和定量限分別為24.93ng·mL-1和56.71ng·mL-1，化合物3 的檢測限和定量限分別為45.85ng·mL-1和103.93ng·mL-1，化合物4 的檢測限和定量限分別為90.84ng·mL-1和144.70ng·mL-1，化合物5 的檢測限和定量限分別為42.42ng·mL-1和83.18ng·mL-1，6 份定量限溶液中各化合物色譜峰保留時間的RSD（n=6）為0.1%～0.2%，峰面積的RSD（n=6）為1.4%～3.5%，表明方法的檢測靈敏度和定量限濃度下的精密度均良好。

2.3 線性和范圍

取1.4 項下對照品混合貯備液適量，用溶劑依次稀釋可得到各化合物濃度分別為0.18、0.3、0.45、0.6、0.9 和1.2μg·mL-1的系列線性溶液（分別相當于限度濃度的30%、50%、75%、100%、150%和200%），在建立的色譜條件下依次進樣測定，記錄色譜圖，以各化合物的峰面積（A）為縱坐標，以濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標進行線性回歸，化合物1～5 的線性范圍依次 為0.182 ～1.211、0.207 ～1.379、0.224～1.491、0.186～1.241、0.185～1.230μg·mL-1，相關系數(shù)r 均大于0.999，線性回歸方程如下：化合物1：y=49112x+307.87，相關系數(shù)r=0.9998；化合物2：y=90560x+815.57，相關系數(shù)r=0.9999；化合物3：y=39359x+388.64，相關系數(shù)r=0.9998；化合物4：y=22887x-133.01，相關系數(shù)r=0.9998；化合物5：y=52958x+263.49，相關系數(shù)r=0.9998。

2.4 準確度

本次研究中準確度以加樣回收率（%）評價，取已測定上述5 個化合物含量的SM1 供試品（化合物2～5 均未檢出，本底量為零）約200mg，精密稱定，置50mL 量瓶中，精密加入1.4 項下對照品混合貯備液適量，用溶劑稀釋至刻度，分別制成相當于限度濃度50%、100%、150%水平的加樣回收率試驗溶液，每個濃度水平平行配制3 份，在建立的色譜條件下依次進樣分析，計算加樣回收率及RSD（n=9）。結果見表1、2。

表1 化合物1 的加樣回收率結果Tab.1 Recovery results of compound 1

表2 化合物2～5 的加樣回收率結果Tab.2 Recovery results of compound 2～5

2.5 進樣精密度

精密量取1.4 項下對照品混合貯備液1.0mL，置于50mL 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為進樣精密度測試溶液，在建立的色譜條件下連續(xù)進樣6 針，記錄色譜圖。

結果各化合物保留時間的RSD（n=6）均為0.1%，各化合物峰面積的RSD（n=6）為0.2%～0.4%，表明系統(tǒng)的進樣精密度良好。

2.6 重復性

精密量取1.4 項下對照品混合貯備液1.0mL，置于50mL 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，平行配制6 份，作為重復性測試溶液，在建立的色譜條件下連續(xù)進樣分析，記錄色譜圖，測定每一份溶液中各化合物的含量，并計算各化合物含量的RSD。結果各化合物含量的RSD（n=6）為0.7%～2.2%，表明方法的重復性良好。

2.7 中間精密度

由不同實驗人員在不同日期，使用不同的儀器，按照2.6 項下的方法進行試驗，將測定結果與重復性項下測得的6 份結果合并計算各化合物含量的RSD。結果各化合物含量的RSD（n=12） 為4.3%～6.0%，表明方法的中間精密度良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性

按照1.4 項下方法制備對照品溶液和供試品溶液，在室溫條件下放置0、4、8、12 和24h 進樣分析，記錄色譜圖，分別考察對照品溶液和供試品溶液中各化合物峰面的變化情況，并以各化合物在不同時間點測得的峰面積與0h 峰面積的比值進行評價。結果各化合物在不同時間點測得的峰面積與0h 峰面積的比值為96.5%～104.3%，表明溶液穩(wěn)定性良好。

根據(jù)質量源于設計（QbD）理念，質量源于良好可靠的設計，必須增加對產(chǎn)品特性的全面了解和對生產(chǎn)過程的可靠控制，并建立設計空間[5]，因此，在藥物生產(chǎn)之前根據(jù)具體工藝的合成機制、起始原料及各中間體的基本結構，充分評估產(chǎn)品的雜質譜，并將相關的雜質在合成的中間體中進行研究和控制是保障藥品質量的有效方法，將相關的雜質控制前置，可避免其在藥品中超限的風險。因此，在本品中建立相關雜質的分析方法并進行嚴格控制，對保障后續(xù)藥品的質量是必要且有效的。

根據(jù)各待測化合物均具有苯環(huán)結構的特點選擇紫外檢測器檢測，化合物1～5 的定量限分別達到76.67、56.71、103.93、144.70 和83.18ng·mL-1，均低于測定條件下各化合物限度濃度的30%，檢測靈敏度滿足檢驗需求?；衔?～5 的平均加樣回收率分別為100.4%、100.4%、102.4%、104.5%和103.7%，化合物1、2、3、5 回收率的RSD 均小于5%，化合物4 因50%濃度水平下回收率略高，進而致使其回收率的RSD 達13.8%，但未超過15%，上述實驗結果滿足現(xiàn)行版《中國藥典》四部通則“9101 分析方法驗證指導原則”對準確度的驗證要求。

3 結論

目前，尚無文獻對本品中的雜質研究進行專門的報道，本研究建立的分析方法已成功應用于SM1中的5 種雜質檢測，為其生產(chǎn)工藝和質量控制提供了有效的支撐，也可為其他醫(yī)藥中間體或藥品的質量控制提供參考。