胡 靜，張瓊芬，凡 姝

(云南大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650021)

染色體易位是比較常見的染色體結(jié)構(gòu)異常，在正常人群中相互易位、羅氏易位發(fā)生概率分別為1/1 000～1/500和1/1 000～1/900，但是在不孕者、反復(fù)流產(chǎn)者中，這種概率會(huì)顯著上升，達(dá)到1%～10%，其嚴(yán)重影響胚胎質(zhì)量，不利于后代健康[1-2]。相關(guān)研究指出，染色體易位攜帶者是在細(xì)胞減數(shù)分裂中，染色體分離重組出現(xiàn)易位染色體和正常染色體高比例不平衡配子，其中羅氏易位攜帶者、相互易位攜帶者的占比分別達(dá)到66%和80%，這種占比較高的不平衡配子容易誘發(fā)反復(fù)流產(chǎn)、畸形胎兒、胚胎停止發(fā)育等情況，其嚴(yán)重影響胚胎的發(fā)育[3-4]。當(dāng)然，由于染色體的相互效應(yīng)，易位染色體還會(huì)影響其它相關(guān)染色體，造成新發(fā)染色體異常。為了更好地避免易位染色體對(duì)胚胎的影響，染色體易位檢測(cè)成為臨床重點(diǎn)研究的問題。臨床上應(yīng)用植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)技術(shù)檢測(cè)羅氏易位攜帶者，而無(wú)創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(shù)(non-invasive fluorescent chromosome screening technology，NICS)是近年培育試管嬰兒的新型技術(shù)，2016年4月在無(wú)錫市婦幼保健院生殖中心誕生了全球首例接受NICS培育的試管嬰兒[5]。為了推廣NICS技術(shù)，本文回顧性地研究了羅氏易位樣本，并分析NICS、PGD的一致性，以便為臨床胚胎移植提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2018年5月至2021年3月在云南大學(xué)附屬醫(yī)院行體外受精-胚胎移植治療的84例不孕婦女的臨床資料為研究對(duì)象，其配偶生殖功能均為正常，本研究通過倫理審查。研究對(duì)象的年齡為18～41歲，平均年齡(27.7±7.0)歲；不孕年限為1～9年，平均不孕年限(4.2±2.1)年；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為17～27kg/m2，平均BMI(22.8±3.0)kg/m2；子宮內(nèi)膜厚度為7.5～13.6mm，平均子宮內(nèi)膜厚度(10.0±1.8)mm。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲；②囊胚數(shù)>2個(gè)；③人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)周期中獲卵≥15個(gè)或者人絨毛膜促性腺激素注射當(dāng)日血清雌二醇水平≥5 000pg/mL。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同源染色體易位者；②BMI≥28kg/m2者；③并發(fā)嚴(yán)重心血管疾病、凝血功能疾病者；④手術(shù)禁忌者；⑤嚴(yán)重精神病者。

1.2檢查方式

對(duì)所有研究對(duì)象都進(jìn)行促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑促排卵，制定和實(shí)施早卵泡期長(zhǎng)效長(zhǎng)促排卵方案，在月經(jīng)第1～4天進(jìn)行陰道B超和血促卵泡激素、孕酮、黃體生成素、雌二醇檢查，注射長(zhǎng)效達(dá)菲林(批準(zhǔn)文號(hào)：H20110290，規(guī)格：3.75mg/支)，28～30天后進(jìn)行復(fù)查，卵泡直徑、子宮內(nèi)膜、雌二醇等指標(biāo)到達(dá)降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)，“主導(dǎo)卵泡群之間≥17mm”與“≥14mm卵泡數(shù)”比值達(dá)60%～70%為扳機(jī)時(shí)機(jī)，注射艾澤(批準(zhǔn)文號(hào)：S20110045，規(guī)格：250μg：0.5mL)扳機(jī)。扳機(jī)后36h采卵，進(jìn)行體外受精。將受精卵相繼進(jìn)行單微滴單胚胎、囊胚養(yǎng)殖。為避免個(gè)案間交叉感染，每個(gè)胚胎都應(yīng)用不同的巴斯德吸管，適當(dāng)通過增加營(yíng)養(yǎng)液提高游離DNA水平，之后將每個(gè)營(yíng)養(yǎng)液轉(zhuǎn)入到5μL細(xì)胞裂解緩沖液的PCR管中保存，保存溫度為-20℃，培養(yǎng)120h，行形態(tài)學(xué)評(píng)估后，對(duì)胚囊進(jìn)行激光皺縮，之后提取30μL進(jìn)行NICS檢測(cè)；同時(shí)，提取接受NICS檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)液中的胚胎細(xì)胞，再接受PGD檢測(cè)。采用美國(guó)Life Tech公司的ION XPRESS LIBRARY試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，再通過純化、洗脫等步驟收集DNA片段，而后進(jìn)行測(cè)序操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(百分率)[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行一致性分析，以P>0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1染色體異常個(gè)案情況

在84例資料中，染色體異常主要集中在8、16、22號(hào)染色體上，表現(xiàn)異常較為明顯，其中8號(hào)染色體異常占比最高，為17.9%(15/84)；在染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量方面，8、16、22號(hào)染色體均表現(xiàn)異常，在個(gè)案數(shù)量方面遠(yuǎn)高于1、2、3、4、5、6、7等其它染色體，見圖1。

注：A為染色體情況;B為結(jié)構(gòu)異常的染色體情況;C為數(shù)量異常的染色體情況。

2.2染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)量異常的一致性檢驗(yàn)

NICS在檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)異常和染色體數(shù)量異常方面，陰性率與陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PGD在檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)異常和染色體數(shù)量異常方面，陰性率與陽(yáng)性率比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NICS、PGD在檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)異常和染色體數(shù)量異常方面均具有一致性(P>0.05)，見表1、表2。

表1 NICS、PGD檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)異常的一致性分析[n(%)]Table 1 Consistency of NICS with PGD in detecting chromosomal structural abnormalities [n (%)]

表2 NICS、PGD檢測(cè)染色體數(shù)量異常的一致性分析[n(%)]Table 2 Consistency of NICS to PGD in detecting numerical abnormalities of the embryonic chromosomes [n (%)]

2.3羅氏易位染色體類型的一致性檢驗(yàn)

NICS、PGD在檢測(cè)正常或者易位染色體和完全新發(fā)染色體異常的陰性率與陽(yáng)性率鑒別檢查比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在相關(guān)染色體異常、相關(guān)+新發(fā)染色體異常的陰性率與陽(yáng)性率鑒別檢查比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；通過一致性檢驗(yàn)，NICS、PGD在檢測(cè)染色體羅氏易位類型方面具有一致性(P>0.05)，見表3。

表3 NICS、PGD檢測(cè)羅氏易位染色體類型的一致性分析[n(%)]Table 3 Consistency between NICS and PGD in detecting types of chromosomal Roche translocation [n(%)]

2.4 NICS和PGD診斷受試者工作特征(ROC)曲線的分析

以個(gè)案加權(quán)NICS、PGD作為檢測(cè)變量，以染色體結(jié)構(gòu)異常作為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線，曲線下面積(AUC)NICS>PGD，但通過檢驗(yàn)，Z=-1.000，P=0.317；靈敏度(χ2=2.000，P=0.157)、特異度(χ2=2.000，P=0.157)，見表4。

表4 NICS、PGD的ROC曲線分析Table 4 Analysis of ROCs of NICS and PGD

圖2 NICS、PGD的ROC曲線圖

3討論

3.1 NICS和PGD檢測(cè)方法分析

PGD是對(duì)體內(nèi)受精配子或者胚胎移入子宮腔內(nèi)進(jìn)行遺傳學(xué)分析，可有效去除遺傳缺陷配子或者胚胎，選取正常胚胎植入子宮中的診斷方式。相關(guān)研究認(rèn)為，PGD是一項(xiàng)有效的輔助生殖技術(shù)，可以早期預(yù)防遺傳病胎兒的妊娠和出生，提高新生兒健康質(zhì)量[6]。該技術(shù)對(duì)后代身心健康影響較小。國(guó)外相關(guān)研究顯示，利用該技術(shù)出生的103例兒童的身高、體重、腰圍、血壓等生命體征差異不明顯，說明了該技術(shù)的適用價(jià)值，且該技術(shù)已被廣泛納入到英國(guó)、德國(guó)、比利時(shí)、法國(guó)、以色列等合法法律規(guī)范中，被認(rèn)為是規(guī)避生殖風(fēng)險(xiǎn)的一種可行方式，對(duì)治療乳腺癌、卵巢癌等遺傳性疾病具有重要意義[7-8]。但是，PGD是通過極體活檢、卵裂活檢、囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢等方式實(shí)施的檢測(cè)，具有一定的操作困難且影響因素多。為了解決這一問題，臨床需謀求全新的輔助生殖技術(shù)。NICS是一種全新的胚胎染色體篩查技術(shù)，其利用游離在胚胎培養(yǎng)液中極微量基因片段，通過單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎染色體的全面篩查[9-10]。該技術(shù)轉(zhuǎn)變了胚胎移植的有創(chuàng)局面，使得胚胎樣本更加安全和完整。相關(guān)研究指出，該技術(shù)適用于高齡患者、反復(fù)流產(chǎn)、羅氏易位攜帶者等，可有效地改善臨床妊娠結(jié)局，提升新生兒妊娠質(zhì)量[11-12]。國(guó)外研究也認(rèn)為，該技術(shù)可有效地檢測(cè)染色體非整數(shù)倍，為臨床妊娠提供技術(shù)支撐[13-14]。

本研究顯示，NICS、PGD檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)異常和染色體數(shù)量異常陰性率與陽(yáng)性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩種方式均可有效地篩查染色體異常情況，是臨床有效的篩查方法。相關(guān)研究指出，NICS是臨床篩查異常染色體及規(guī)避異常妊娠、流產(chǎn)、胎兒畸形等方面的有效方法[15]。NICS是一項(xiàng)操作簡(jiǎn)便、安全可靠的胚胎植入前染色體檢測(cè)方式，是將傳統(tǒng)有創(chuàng)活檢轉(zhuǎn)變?yōu)闋I(yíng)養(yǎng)液無(wú)創(chuàng)采集的檢測(cè)方式。該技術(shù)是由億康基因提出的，通過MALBAC技術(shù)結(jié)合第二代高通量測(cè)序方法，檢測(cè)培養(yǎng)至囊胚期的培養(yǎng)液，從而比較染色體非整數(shù)倍情況。該方法節(jié)約技術(shù)成本、促進(jìn)單胚胎移植、適用于高齡產(chǎn)婦、有助于子代健康。NICS、PGD兩者在染色體結(jié)構(gòu)異常和數(shù)量異常方面通過一致性檢驗(yàn)，表明兩種技術(shù)應(yīng)用在胚胎染色體篩查方面效果顯著，臨床實(shí)踐中可根據(jù)條件選取其中一種檢測(cè)方式，為胚胎移植成功提供便利方法。

3.2羅氏易位染色體檢測(cè)的一致性分析

本研究顯示，從羅氏易位染色體類型來看，NICS、PGD在檢測(cè)正常或者易位染色體和完全新發(fā)染色體異常的陰性率與陽(yáng)性率鑒別檢查比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明這兩種檢測(cè)方式有助于鑒別陰性與陽(yáng)性，但是在相關(guān)染色體異常、相關(guān)+新發(fā)染色體異常陰性率與陽(yáng)性率鑒別檢查差異并不明顯，這或許與樣本量較少及檢測(cè)樣本問題等相關(guān)，但是兩者通過檢驗(yàn)具有較高的一致性，檢測(cè)胚胎染色體羅氏易位有較高的臨床價(jià)值。相關(guān)研究指出，羅氏易位染色體除了13、14、15、21號(hào)外，還牽扯到其它染色體，同時(shí)羅氏易位染色體尤其集中在8、16、22號(hào)染色體異常中[16]，這與本研究結(jié)果一致。NICS、PGD的ROC曲線結(jié)果差異并不顯著，表明這兩種方式對(duì)羅氏易位染色體中的結(jié)構(gòu)異常檢測(cè)具有一定的一致性，均可應(yīng)用于臨床在該方面的診斷。

綜上所述，NICS、PGD檢測(cè)效果顯著，適用于臨床，同時(shí)兩者在染色體結(jié)構(gòu)異常、數(shù)量異常、類型檢測(cè)等方面具有一致性，可根據(jù)臨床實(shí)際條件選用相關(guān)技術(shù)。本文研究的創(chuàng)新點(diǎn)：一是彌補(bǔ)了NICS、PGD在檢測(cè)羅氏易位染色體文獻(xiàn)研究中的缺失，通過比較NICS、PGD對(duì)羅氏易位染色體檢測(cè)的一致性，為臨床診斷提供理論借鑒；二是肯定了NICS、PGD在檢測(cè)羅氏易位染色體類型、染色體結(jié)構(gòu)異常、染色體數(shù)量異常的應(yīng)用價(jià)值；三是應(yīng)用圖表直觀表達(dá)了NICS、PGD檢測(cè)結(jié)果的異同。當(dāng)然，本研究也存在一些不足：首先是本研選用的樣本量有限，影響了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此需要通過大樣本進(jìn)一步論證；其次是本研究缺乏多中心對(duì)照實(shí)驗(yàn)，因此尚需通過多中心、大樣本、對(duì)照組實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步豐富及論證，以便為臨床檢測(cè)提供新思路。