李 闖， 馬曉莉， 文志萍， 陳衛(wèi)軍， 袁 勇， 王新春， 曹文疆

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)嚴(yán)重制約著心血管疾病患者的救治成功率。目前仍然沒(méi)有非常有效的措施避免因再灌注而引起的心肌損傷[1-3]。因此，對(duì)MIRI的發(fā)病機(jī)理以及預(yù)防藥物的研究已經(jīng)成為近年來(lái)醫(yī)藥工作者的重大研究課題之一。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)/過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)信號(hào)通路與氧化應(yīng)激和線粒體保護(hù)密切相關(guān)。缺血再灌注時(shí)，線粒體內(nèi)活性氧(ROS)爆發(fā)并累積，大量的ROS損傷線粒體內(nèi)外膜及周圍大分子物質(zhì)，使線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂，造成氧化應(yīng)激損傷，從而使AMPK被激活[4-7]。活化后的AMPK通過(guò)增強(qiáng)分解代謝，抑制合成代謝，緩解能量應(yīng)激狀態(tài)[8-9]。PGC-1α作為其下游蛋白分子，參與氧化應(yīng)激、能量代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等[10-11]。激活后的AMPK和SIRT1分別通過(guò)磷酸化作用和去乙酰化作用直接或間接影響PGC-1α的活性，PGC-1α是線粒體生物合成和氧化代謝過(guò)程中主要的調(diào)節(jié)因子[12-13]，通過(guò)調(diào)控線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)，參與調(diào)節(jié)線粒體生物合成、能量代謝以及氧化應(yīng)激，在改善線粒體結(jié)構(gòu)及功能中發(fā)揮重要的作用[14-15]。

香青蘭總黃酮是提取自新疆特色資源植物藥香青蘭中的一類天然黃酮類活性成分。課題組前期研究表明，香青蘭總黃酮對(duì)MIRI大鼠線粒體具有保護(hù)作用[16-19]。其機(jī)制是否與調(diào)控AMPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)尚不明確。因此，本文通過(guò)研究香青蘭總黃酮預(yù)處理對(duì)MIRI大鼠的氧化應(yīng)激和線粒體保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制，為香青蘭總黃酮防治MIRI提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～270 g，由新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(新)2016-0001。操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑與藥物 香青蘭總黃酮提取物(由新疆藥物研究所提供，純度57%，批號(hào)20141008)。TTC(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)531D036)；烏拉坦麻醉藥(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，批號(hào) 20151106)；Compound C(貨號(hào)S7840)、EX-527(貨號(hào)S1541)均購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；活性氧(ROS)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Anti-AMPKα1+α2 (貨號(hào)ab131512)、Anti-AMPK phospho α1+α2 (貨號(hào)ab23875)、Anti-SIRT1 (貨號(hào)ab110304)、Anti-PGC-1α (貨號(hào)ab191838)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器 Pico-17臺(tái)式低溫離心機(jī)、Varioskan Flash 3001多功能酶標(biāo)測(cè)定儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；HX-300呼吸裝置(成都泰盟軟件有限公司)；-80 ℃冰箱(青島海爾股份有限公司)；EOL-JEM-1230透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；EM-UC6超薄型切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；脫色搖床儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；恒溫電熱培養(yǎng)箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 50只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組，生理鹽水灌胃；模型組，生理鹽水灌胃；香青蘭總黃酮組，每天灌胃60 mg/kg香青蘭總黃酮；香青蘭總黃酮+AMPK抑制劑Compound C組，每天灌胃60 mg/kg香青蘭總黃酮，再在灌注前20 min尾靜脈注射250 μg/kg Compound C；香青蘭總黃酮+SIRT1抑制劑EX-527組，每天灌胃60 mg/kg香青蘭總黃酮，再于灌注前20 min腹腔注射5 mg/kg EX-527，連續(xù)7 d，給藥結(jié)束后建立MIRI模型。

2.2 建模及取材 25%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定于恒溫加熱板，胸部脫毛，氣管插管，開(kāi)胸，呼吸機(jī)連接。暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎完成后心臟復(fù)位。缺血30 min后剪斷結(jié)扎線，再灌注120 min，迅速剪取心臟，置于冰生理鹽水中，清洗心臟，于-80 ℃冰箱中保存。假手術(shù)組同法操作，但不進(jìn)行結(jié)扎。

2.3 大鼠心肌梗死程度檢測(cè) 1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyte-trazolium chloride，TTC)染色法檢測(cè)心肌梗死面積。各組大鼠心臟于-20 ℃速凍30 min后，切成等厚度的5片薄片，放入1% TTC染液中，37 ℃恒溫水浴避光染色30 min，PBS沖洗切片3次，10%甲醛固定切片12 h，梗死心肌是TTC著色部分，呈灰白色；TTC不著色部分是正常心肌，呈磚紅色。采集圖像，Image J軟件處理。心肌梗死面積=(梗死面積之和/全心面積)×100%。

2.4 大鼠心肌組織ROS水平檢測(cè) 采用ROS檢測(cè)試劑盒。DCFH-DA活性氧檢測(cè)探針自身沒(méi)有熒光，在細(xì)胞內(nèi)被水解為DCFH，再被氧化為不能通過(guò)細(xì)胞膜的強(qiáng)綠色熒光物質(zhì)DCF，在激發(fā)波長(zhǎng)502 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm左右有最大吸收峰，以熒光度值/mg蛋白(a.u./mgpro)表示結(jié)果。

2.5 大鼠血清SOD活性、MDA水平檢測(cè) 按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，并計(jì)算SOD活性和MDA水平。

2.6 免疫組化法檢測(cè)心肌組織AMPK、SIRT1及PGC-1α表達(dá) 將制好的石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，PBS緩沖液清洗3次，每次3 min，高壓修復(fù)抗原用pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液，PBS緩沖液清洗2次，每次5 min，3% H2O2孵育10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS緩沖液清洗2次，每次5 min，滴加一抗(AMPK、SIRT1、PGC-1α稀釋比例分別為1∶40、1∶50、1∶100)，4 ℃過(guò)夜后37 ℃復(fù)溫30 min，PBS清洗2次，每次5 min，滴加辣根酶IgG復(fù)合物，37 ℃孵育30 min，蒸餾水清洗3次，1%鹽酸酒精分化15～30 s，蒸餾水清洗3次，最后過(guò)梯度乙醇及二甲苯進(jìn)行脫水，中性樹(shù)膠封片，自然晾干后熒光200倍顯微鏡下觀察。棕黃色表達(dá)即為陽(yáng)性表達(dá)。胞漿表達(dá)的蛋白以灰度值表示，陽(yáng)性率=IOD/area；對(duì)于核表達(dá)的蛋白，陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞核個(gè)數(shù)/視野中所有細(xì)胞核個(gè)數(shù)。

2.7 心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 造模結(jié)束后，心肌組織切為1 mm×1 mm×1 mm小塊，2.5%戊二醛液固定24 h以上，0.1%磷酸漂洗，1%鋨酸固定1 h，磷酸緩沖液沖洗，50%、70%、80%、90%丙酮梯度脫水1 min，丙酮脫水2次，每次10 min，環(huán)氧樹(shù)脂812常規(guī)包埋，37 ℃恒溫箱中過(guò)夜后移到45 ℃恒溫箱中12 h，60 ℃放置24 h，超薄切片，硝酸鉛-醋酸雙氧鈾染色，JEOL-1230透射電子顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響 假手術(shù)組大鼠心肌呈磚紅色，沒(méi)有發(fā)生心肌梗死；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積百分比增加(P<0.01)；與模型組比較，香青蘭總黃酮組大鼠心肌梗死面積百分比降低(P<0.01)；與香青蘭總黃酮組比較，香青蘭總黃酮聯(lián)合AMPK及SIRT1抑制劑組心肌梗死面積百分比均增加(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

注：A為各組大鼠TTC染色， B為各組大鼠相對(duì)心肌梗死面積。與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與香青蘭總黃酮組比較，&&P<0.01。圖1 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響Fig.1 Effects of D. moldavica total flavonoids on myocardial infarction area in rats

3.2 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌組織ROS水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織ROS水平升高(P<0.01)；與模型組比較，香青蘭總黃酮組大鼠心肌ROS水平降低(P<0.01)；與香青蘭總黃酮組比較，香青蘭總黃酮聯(lián)合AMPK及SIRT1抑制劑組ROS水平升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌組織ROS水平的影響

3.3 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠血清SOD活性和MDA水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清SOD活性降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，香青蘭總黃酮組大鼠血清SOD活性升高(P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)；與香青蘭總黃酮組比較，香青蘭總黃酮聯(lián)合AMPK抑制劑及SIRT1抑制劑組大鼠血清SOD活性降低，MDA水平升高(P<0.01)，見(jiàn)表2。

3.4 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌組織AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)的影響 AMPK主要在細(xì)胞核表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)少量表達(dá)；SIRT1及PGC-1α在質(zhì)、核都有表達(dá)，棕褐色即陽(yáng)性表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；與模型組比較，香青蘭總黃酮組大鼠心肌組織中AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；與香青蘭總黃酮組比較，香青蘭總黃酮聯(lián)合AMPK抑制劑及SIRT1抑制劑組大鼠心肌組織中AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)減少(P<0.01)，見(jiàn)圖2、表3。

表2 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠血清SOD活性和MDA水平的影響

圖2 各組大鼠心肌組織AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)(免疫組化，×200)Fig.2 Myocardial protein expressions of AMPK, SIRT1 and PGC-1α of rats in each group(immunocytochemistry，×200)

3.5 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組大鼠心肌組織線粒體外膜光滑，內(nèi)膜褶皺呈嵴，嵴形狀規(guī)則，線粒體光密度居中，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)明顯，肌纖維整齊排列；模型組大鼠心肌組織線粒體嵴突紊亂、斷裂甚至消失，或溶解到無(wú)正常結(jié)構(gòu)，肌絲排列散而亂；香青蘭總黃酮組大鼠心肌組織線粒體膜基本完整，嵴突基本完整，部分消失，少部分?jǐn)嗔眩〗z排列整齊，線粒體損傷程度較模型組明顯減輕；香青蘭總黃酮聯(lián)合AMPK抑制劑及SIRT1抑制劑組大鼠心肌組織線粒體損傷程度明顯高于香青蘭總黃酮組，線粒體膜基本消失，嵴斷裂、紊亂，肌絲松散，見(jiàn)圖3。

表3 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌組織AMPK、SIRT1、PGC-1α表達(dá)的影響

4 討論

香青蘭總黃酮對(duì)MIRI的保護(hù)作用中，心肌梗死面積是評(píng)價(jià)心肌損傷程度以及模型成功的重要指標(biāo)。本研究顯示，采用結(jié)扎SD大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支能導(dǎo)致大鼠心肌梗死面積的增加，而香青蘭總黃酮能降低MIRI模型大鼠心肌梗死面積，對(duì)MIRI大鼠具有明顯的保護(hù)作用。但是，香青蘭總黃酮聯(lián)合AMPK及SIRT1抑制劑后，香青蘭總黃酮對(duì)心肌的保護(hù)作用被抑制，提示AMPK和SIRT1直接或間接參與香青蘭總黃酮對(duì)心肌組織的保護(hù)作用。

線粒體是心肌產(chǎn)能的場(chǎng)所，線粒體的穩(wěn)態(tài)和平衡是決定心肌細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素，線粒體如果腫脹、破裂和水解，會(huì)致使細(xì)胞死亡，并且受損的線粒體產(chǎn)生的活性氧是正常線粒體的十余倍，再灌注期ROS爆發(fā)，導(dǎo)致機(jī)體的氧化還原狀態(tài)失衡，氧化還原狀態(tài)對(duì)于機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持起著重要的作用，尤其機(jī)體抗氧化能力的高低是抗氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵。因此，降低線粒體活性氧水平，保護(hù)線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持起著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，香青蘭總黃酮組大鼠心肌組織ROS水平降低，線粒體的超微結(jié)構(gòu)損傷明顯得到改善；香青蘭總黃酮聯(lián)合AMPK及SIRT1抑制劑組大鼠心臟組織ROS水平以及線粒體的超微結(jié)構(gòu)損傷均明顯高于香青蘭總黃酮組，說(shuō)明香青蘭總黃酮對(duì)心肌ROS的降低作用以及線粒體的保護(hù)作用均被抑制劑所抵消。表明AMPK和SIRT1參與香青蘭總黃酮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

在MIRI模型中，PGC-1α通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)因子如SOD、MDA等的表達(dá)，SOD是抗氧化應(yīng)激酶，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，反映機(jī)體抗氧化能力。AMPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路可以通過(guò)感應(yīng)機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，在心肌細(xì)胞線粒體生物合成及氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，香青蘭總黃酮組大鼠血清中SOD活性及心肌組織AMPK、SIRT1、PGC-1α表達(dá)均增加，血清MDA水平降低；香青蘭總黃酮聯(lián)合AMPK及SIRT1抑制劑后，血清SOD活性及心肌組織AMPK、SIRT1、PGC-1α表達(dá)均降低，血清中MDA水平升高。提示香青蘭總黃酮可以通過(guò)AMPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，香青蘭總黃酮可以減輕MIRI的心肌梗死程度，降低ROS及MDA水平，提高SOD活性，抗氧化應(yīng)激損傷，改善MIRI過(guò)程中的線粒體結(jié)構(gòu)損傷，而以上保護(hù)作用則均被AMPK及SIRT1抑制劑所抑制，表明香青蘭總黃酮可能通過(guò)激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路參與心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能以及氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)。