王 瑩 李勝男 胡幸娟 黃少婷 吳釗淳 何嘉文 李 友

miRNA是一類長(zhǎng)度約為18～24個(gè)核苷酸的低分子非編碼RNA，能夠通過(guò)特異性結(jié)合mRNA的3′-非翻譯區(qū)來(lái)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)以完成神經(jīng)元的增殖和分化功能，是腦卒中發(fā)生的病因和病理進(jìn)程中的關(guān)鍵因子。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，缺血性腦卒中發(fā)生中有超過(guò)20%的miRNA發(fā)生了變化[1]。其中miRNA-9在大腦中高度富集，它不僅參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程，還參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥等多種生物學(xué)過(guò)程。

腦卒中是腦血管在各種因素的作用下，突然破裂出血或者栓塞、梗死、缺血，而造成的一系列臨床癥狀。主要包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中兩種類型[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)腦卒中患者中約有30%的患者死亡，剩余70%的患者存在不同程度的殘疾[3]。研究表明，miRNA-9與腦卒中發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切關(guān)聯(lián)。在大鼠的腦缺血再灌注(cerebral ischemia/reperfusion, I/R)模型中，腦梗死部位缺血組織中的miRNA-9水平表達(dá)顯著降低[4,5]。在體外神經(jīng)細(xì)胞的氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型中，miRNA-9的表達(dá)也呈明顯降低趨勢(shì)；將miRNA-9的模擬物轉(zhuǎn)染入細(xì)胞可有效逆轉(zhuǎn)OGD/R模型中細(xì)胞活力的抑制作用，表明其對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞功能性損傷具有保護(hù)作用[6]。以上研究證實(shí)，miRNA-9 參與腦卒中的調(diào)控過(guò)程并且可減輕缺血缺氧誘導(dǎo)下神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-9參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的分子機(jī)制異常復(fù)雜，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥發(fā)生、神經(jīng)修復(fù)及血管重塑等，這些生物學(xué)過(guò)程均與腦卒中的發(fā)生、發(fā)展及治療修復(fù)存在密切聯(lián)系。

一、miRNA-9參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是機(jī)體重要的蛋白質(zhì)合成和加工場(chǎng)所，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧等病理過(guò)程時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)從而影響相關(guān)蛋白質(zhì)的正常合成。ER應(yīng)激是缺血引起的重要因素，特定的ER應(yīng)激抑制劑已被證明可減輕大鼠缺血/再灌注引起的海馬神經(jīng)元損傷[6,7]。因此研究ER應(yīng)激的機(jī)制可能對(duì)缺血性腦卒中的治療提供新的視角。Chi等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在I/R模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(ERMP1、GRP78、p-PERK、p-eIF2α和 CHOP)的表達(dá)均明顯上調(diào)，而在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miRNA-9可明顯下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)金屬蛋白酶1(endoplasmic reticulum metalloproteinase-1,ERMP1)是一種鋅結(jié)合蛋白酶，其定位于9p24 號(hào)染色體，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要介質(zhì)。Chi等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-9 通過(guò)直接靶向ERMP1負(fù)調(diào)節(jié) ERMP1的表達(dá)從而降低OGD處理后的細(xì)胞中的ER應(yīng)激反應(yīng)。相反地，過(guò)表達(dá)ERMP1可逆轉(zhuǎn)miRNA-9誘導(dǎo)的ER應(yīng)激的保護(hù)作用[8]。miRNA-9對(duì)缺血性損傷的保護(hù)作用可能與靶向ERMP1介導(dǎo)的ER應(yīng)激有關(guān)，并且通過(guò)靶向ERMP1，使ER應(yīng)激失活來(lái)保護(hù)缺血性腦損傷。

二、miRNA-9參與凋亡過(guò)程

凋亡引起的腦神經(jīng)元細(xì)胞功能喪失是缺血性腦卒中最突出的病理變化。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡，它在缺血性腦卒中等病理?xiàng)l件下被激活[9]。神經(jīng)元在壞死核周圍的局部缺血半暗帶中血流相對(duì)充足，因此仍能保持基本的活性代謝和功能[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，缺血性半暗帶中的神經(jīng)元細(xì)胞在缺血性腦卒中后有概率恢復(fù)，然而由于時(shí)間窗的限制，患者容易錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間，因此抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡成為治療腦卒中及改善腦卒中預(yù)后的一種新的方向[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-9在嚙齒動(dòng)物的神經(jīng)源性區(qū)域中高表達(dá)[12]。

Bcl2l11是一種與凋亡相關(guān)的因子，參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程[13]，拮抗抗凋亡蛋白的表達(dá)，激活促凋亡蛋白Bax從而發(fā)揮作用[14]。lncRNA TUG1與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，參與調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等過(guò)程[15,16]。Wei等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2l11在缺血腦組織MCAO模型和OGD模型中均表達(dá)增加。miRNA-9可以靶向調(diào)控Bcl2l11，抑制miRNA-9的表達(dá)導(dǎo)致缺血性腦組織Bcl2l11的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。Chen等[11]揭示了在缺血腦組織MCAO模型和OGD模型中l(wèi)ncRNA TUG1表達(dá)增加；miRNA-9表達(dá)降低。過(guò)表達(dá)lncRNA TUG1可抑制miRNA-9的表達(dá)從而增加Bcl2l11的表達(dá)，最終促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。敲除lncRNA TUG1可增加miRNA-9表達(dá)進(jìn)而抑制Bcl211的表達(dá)最終減弱細(xì)胞凋亡。

三、miRNA-9參與調(diào)控炎癥過(guò)程

炎癥是腦血管疾病尤其是缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中繼發(fā)性損傷機(jī)制的重要因素[17]。研究表明，缺血后神經(jīng)炎癥是缺血性腦卒中及其長(zhǎng)期預(yù)后的重要決定因素[18]。在缺血性腦損傷中，受損組織、壞死細(xì)胞、碎片和ROS共同引發(fā)了炎性反應(yīng)。這些觸發(fā)因素導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活和大量炎性細(xì)胞因子的釋放。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的固有先天免疫巨噬細(xì)胞，它們?cè)谀X損傷后高度激活[19]。炎性細(xì)胞因子釋放引發(fā)了缺血后炎癥并加重原發(fā)性腦損傷。

NF-κB1是一種異聚轉(zhuǎn)錄因子，參與促炎性細(xì)胞因子的激活，調(diào)控促炎性細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β和iNOS)的產(chǎn)生從而引起炎性反應(yīng)和神經(jīng)元死亡[20]。Nampoothiri等[21]研究指出，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的OGD模型中，通過(guò)定量測(cè)定促炎性細(xì)胞因子如NF-κB1、TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)均升高，分別轉(zhuǎn)染miRNA-9模擬物和葡萄糖胺進(jìn)入細(xì)胞后這些促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)均降低。有研究也發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miRNA-9可通過(guò)抑制NF-κB1與降低 TNF-α和IL-1β的表達(dá)而減少了局部/全身的炎性反應(yīng)[20～22]。促炎性細(xì)胞因子水平的降低反映出上調(diào)miRNA-9可能減輕了 OGD/R 后神經(jīng)元死亡的急性炎性反應(yīng)。

四、miRNA-9參與神經(jīng)元存活與再生

一些在腦組織中高表達(dá)的miRNA可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元增殖和分化的生物學(xué)過(guò)程[23]。調(diào)節(jié)這些miRNA的活性可能對(duì)缺血性腦卒中有重要的治療意義。近年來(lái)研究的重心已經(jīng)轉(zhuǎn)為了神經(jīng)元細(xì)胞的恢復(fù)，這種策略有助于改善缺血性腦卒中后的神經(jīng)功能恢復(fù)[24]。ATP是存在于所有代謝活躍細(xì)胞中的細(xì)胞活力的標(biāo)志物，可以誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的增殖和分化。Nampoothiri等[21]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-9模擬物后的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯增加，并且miRNA-9上調(diào)直接增加了暴露于OGD/R的細(xì)胞中的ATP水平，這些結(jié)果進(jìn)一步印證了miRNA-9可以提高神經(jīng)元細(xì)胞的增殖和分化功能。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-9和組蛋白脫乙酰基酶4(HDAC4)在缺血性腦卒中后的神經(jīng)損傷中有較強(qiáng)的相關(guān)性[25]。

組蛋白脫乙?；?(HDAC4)是Ⅱa類特異性HDAC，其在缺血性腦卒中發(fā)生過(guò)程中可穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間，在缺血應(yīng)激條件下，HDAC4從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核從而介導(dǎo)神經(jīng)元死亡[26]。Nampoothiri等[21]預(yù)測(cè)miRNA-9和HDAC4是缺血性腦卒中后導(dǎo)致的神經(jīng)損傷的重要調(diào)節(jié)劑，之后進(jìn)一步證明miRNA-9可負(fù)調(diào)節(jié)HDAC4的表達(dá)，反之降低HDAC4的表達(dá)并減輕體外缺血性損傷。葡萄糖胺可結(jié)合HDAC4降低HDAC4水平并提高OGD后細(xì)胞中miRNA-9的表達(dá)。因此葡萄糖胺可作為miRNA-9上調(diào)的合適低分子替代物。通過(guò)研究葡萄糖胺替代miRNA-9療法，證實(shí)了miRNA-9模擬物和葡萄糖胺能緩解神經(jīng)元凋亡和壞死，促進(jìn) OGD后神經(jīng)元存活和細(xì)胞增殖，并且對(duì)OGD后神經(jīng)突生長(zhǎng)有很明顯的促生長(zhǎng)作用[21]。Litke等[27]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)突觸長(zhǎng)度的增加可能與HDAC4的失活和miRNA-9的上調(diào)有關(guān)，聚集的核HDAC4可使神經(jīng)元樹突的長(zhǎng)度急劇減少。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)低分子miRNA-9的表達(dá)可控制缺血性腦卒中神經(jīng)元的存活與再生修復(fù)。

五、miRNA-9參與血管生成/血管重塑

研究表明，miRNA-9參與調(diào)節(jié)血管生成過(guò)程。血管生成是缺血性腦卒中組織自我修復(fù)的重要有益事件。大量新生血管可為缺血組織提供充足的氧氣與營(yíng)養(yǎng)供給，可有效改善缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能恢復(fù)效果。調(diào)節(jié)血管生成過(guò)程的miRNA 已被用作治療缺血性腦卒中的潛在策略。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在缺血性腦卒中中具有重要治療潛力[28]。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，過(guò)表達(dá)Bcl-2會(huì)抑制由缺血性腦卒中引起的神經(jīng)元細(xì)胞死亡[29]。Nampoothiri等[21]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF和Bcl-2共同表達(dá)可抑制缺血性腦細(xì)胞凋亡，在腦細(xì)胞缺血模型中，抑制miRNA-9降低了VEGF和Bcl-2的表達(dá)，相應(yīng)地，過(guò)表達(dá)miRNA-9促進(jìn)了VEGF表達(dá)，因此miRNA-9可能通過(guò)調(diào)控VEGF進(jìn)而增加血管生成。由此可見，miRNA-9在神經(jīng)發(fā)育的不同階段發(fā)揮了不同的作用。

綜上所述，miRNA-9參與調(diào)控了缺血性腦卒中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡、炎癥、神經(jīng)再生及血管重塑等過(guò)程，是缺血性腦卒中研究進(jìn)展中的重要分子，它揭示了缺血性腦卒中潛在的發(fā)病機(jī)制，并為缺血性腦卒中的治療提供了更多的研究方向和思路。但目前的研究局限于動(dòng)物和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，未來(lái)需要進(jìn)一步探究人體組織中miRNA-9的作用機(jī)制。