李寶瑩 運(yùn)晨霞

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種發(fā)病原因多樣、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)以關(guān)節(jié)持續(xù)性炎癥和不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞等為主要特征的自身免疫性疾病[1]。有研究表明，RA發(fā)病關(guān)鍵的風(fēng)險(xiǎn)因素是遺傳易感性，其中主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)決定著機(jī)體免疫應(yīng)答和免疫穩(wěn)態(tài)的相互關(guān)系，在自身免疫病的發(fā)生中起著重要的作用[2]。人類MHC被稱為人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)復(fù)合體，HLA-Ⅱ類基因的DR區(qū)與RA的易感有關(guān)，其中HLA-DRB1基因是RA已知的易感基因[3]。通過(guò)檢測(cè)具有HLA-DRB1基因的RA患者對(duì)早期免疫抑制治療有積極的作用[4]。

為深入開(kāi)展和了解RA的致病過(guò)程，RA動(dòng)物模型是必不可少的工具。嚙齒類動(dòng)物因其成本低、遺傳背景明確和操作方便等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。目前常選嚙齒類中的大鼠和小鼠作為模式動(dòng)物，本文就5種常用刺激劑誘導(dǎo)的嚙齒類動(dòng)物RA模型的特征、不同品系的大鼠、小鼠對(duì)刺激劑的易感性及動(dòng)物模型構(gòu)建時(shí)需要注意的關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行概述。

一、佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(adjuvant induced arthritis, AIA)模型

佐劑可分為弗氏完全佐劑(complete Freund′s adjuvant, CFA)和弗氏不完全佐劑(incomplete Freund adjuvant, IFA)，兩者主要區(qū)別在于CFA添加了熱滅活的結(jié)核桿菌。用 CFA制備AIA模型時(shí)，由于結(jié)核桿菌含有與關(guān)節(jié)滑膜上糖蛋白分子結(jié)構(gòu)相似的分子結(jié)構(gòu)，可誘發(fā)交叉免疫反應(yīng)，激活T淋巴細(xì)胞過(guò)度增殖并攻擊關(guān)節(jié)軟骨中的C抗原成分，產(chǎn)生大量的腫瘤壞子因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β等炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致持續(xù)性炎癥發(fā)生，如壞死性肉芽腫[5]。用IFA制備AIA模型時(shí)，由于佐劑缺乏結(jié)核桿菌細(xì)胞壁成分或其他含有多肽成分，誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎是慢性、關(guān)節(jié)特異性的，受T淋巴細(xì)胞和MHC基因調(diào)節(jié)。不同的是，CFA中含有熱滅活的結(jié)核桿菌能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的偏向Th1型的細(xì)胞免疫應(yīng)答；IFA主要引起體液免疫應(yīng)答，偏向Th2型反應(yīng)。

本模型的造模方法是通過(guò)將佐劑注射到動(dòng)物的尾根部來(lái)刺激激活遠(yuǎn)端四肢等關(guān)節(jié)炎癥，由于注射部位遠(yuǎn)離發(fā)生炎癥的部位，可完全排除注射刺激導(dǎo)致的非特異性炎癥的干擾[6]。動(dòng)物發(fā)病時(shí)炎癥首先出現(xiàn)在注射部位，繼發(fā)在身體其他部位出現(xiàn)關(guān)節(jié)的腫脹、足趾紅腫且進(jìn)行性加重導(dǎo)致行動(dòng)不便等現(xiàn)象，病理表現(xiàn)可見(jiàn)滑膜增殖、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和軟骨退化等改變，這些表現(xiàn)與人RA相似。

在動(dòng)物選擇方面，較多選用大鼠，大鼠在構(gòu)建AIA模型時(shí)受遺傳背景中的MHC和非MHC基因控制，因此了解不同品系大鼠的遺傳背景有助于提高AIA模型構(gòu)建時(shí)的易感性。一般AIA模型構(gòu)建時(shí)多采用Wistar、LEW(Lewis)和SD(Sprague-Dawley)大鼠，誘導(dǎo)10～14天可觀察到關(guān)節(jié)炎的癥狀。但造模過(guò)程中大鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答方面出現(xiàn)明顯異常，而體液免疫應(yīng)答不明顯，這與RA患者大多表現(xiàn)為體液免疫應(yīng)答與細(xì)胞免疫應(yīng)答方面皆異常的表現(xiàn)有明顯區(qū)別，是AIA模型的不足之一。小鼠也可經(jīng)CFA誘導(dǎo)成AIA模型，但小鼠AIA模型病程持續(xù)時(shí)間較短。

二、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型

Trentham等[7]利用Ⅱ型膠原蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了自身免疫性關(guān)節(jié)炎，因其許多與人RA相似的病理和免疫學(xué)特征而被廣泛研究。臨床研究表明，血清中抗天然Ⅱ型膠原蛋白抗體具有軟骨降解的作用，與關(guān)節(jié)炎侵蝕損害程度有關(guān)。Ⅱ型膠原蛋白可從多種動(dòng)物(大鼠、小鼠、牛、人、豬和雞)中獲得，不同種屬間Ⅱ型膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)存在保守性，導(dǎo)致不同種屬來(lái)源的Ⅱ型膠原蛋白能與自身抗體發(fā)生交叉反應(yīng)[8]。

本模型在制備時(shí)常將Ⅱ型膠原蛋白乳化在CFA或IFA中，對(duì)易感的嚙齒類動(dòng)物(大鼠和小鼠)進(jìn)行皮內(nèi)免疫，Ⅱ型膠原蛋白進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞加工、分解成多個(gè)多肽片段被MHC-Ⅱ類分子提呈給T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞活化后產(chǎn)成大量的炎性細(xì)胞因子引發(fā)CIA的病理進(jìn)程[9]。同時(shí)，活化的T淋巴細(xì)胞可輔助B淋巴細(xì)胞活化分泌IgM型Ⅱ型膠原蛋白抗體，該抗體與Ⅱ型膠原蛋白形成免疫復(fù)合物沉積在關(guān)節(jié)滑膜部位，激活補(bǔ)體系統(tǒng)進(jìn)一步使炎性細(xì)胞活化從而引起關(guān)節(jié)滑膜的炎癥和軟骨的損傷，動(dòng)物通常在免疫1～2周后就開(kāi)始出現(xiàn)關(guān)節(jié)的腫脹[10]。免疫過(guò)程具體分為兩個(gè)階段，第1階段注射Ⅱ型膠原蛋白與CFA混合物；第2階段注射Ⅱ型膠原蛋白與CFA混合物，炎癥表現(xiàn)較為強(qiáng)烈；若采用Ⅱ型膠原蛋白與IFA混合物則骨侵蝕破壞更明顯。后期炎性反應(yīng)開(kāi)始逐步減弱或消退時(shí)可進(jìn)行再次免疫延長(zhǎng)炎癥。不同的是，第2階段的加強(qiáng)免疫大鼠多選擇在7～10天，小鼠多選擇在第21天左右進(jìn)行[11]。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型在免疫學(xué)及病理學(xué)上的變化與人RA有一些共同的臨床和組織病理學(xué)特征，如關(guān)節(jié)腫脹明顯，關(guān)節(jié)病理染色可觀察到增殖性滑膜炎以及侵蝕性血管翳等炎癥特征，體內(nèi)可檢測(cè)到抗Ⅱ型膠原蛋白抗體、皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)和關(guān)節(jié)降解表現(xiàn)[12]。

在動(dòng)物選擇方面，大鼠在構(gòu)建CIA模型時(shí)多選用鼠齡7～8周、對(duì)CIA高度易感的SD、Wistar、BB(Bio-Breeding)、LEW、DA(Dark Agouti)等，其中在CIA研究中雄性大鼠占78.69%[13]。不同的是，同源性大鼠Ⅱ型膠原蛋白易誘導(dǎo)DA大鼠發(fā)生多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，異源性雞Ⅱ型膠原蛋白能誘導(dǎo)DA、BB、LEW等品系大鼠發(fā)生較強(qiáng)的炎性反應(yīng)[14]。小鼠CIA模型多選用鼠齡7～8周、品系為DBA/1、BALB/C、C57BL/6和B10.RIII的小鼠和異源性Ⅱ型膠原蛋白來(lái)誘導(dǎo)。DBA/1小鼠和B10.RIII小鼠因擁有的H-2q和H-2r基因，使其易受到T淋巴細(xì)胞的抗原識(shí)別導(dǎo)致CIA敏感度很高，兩者皆對(duì)牛和豬來(lái)源的Ⅱ型膠原蛋白較敏感[15]；不同的是，DBA/1小鼠對(duì)雞Ⅱ型膠原蛋白可誘導(dǎo)較強(qiáng)的血清反應(yīng)，B10.RIII小鼠對(duì)雞Ⅱ型膠原蛋白反應(yīng)較差[16]。BALB/C小鼠對(duì)牛來(lái)源的Ⅱ型膠原蛋白有反應(yīng)，C57BL/6小鼠對(duì)雞來(lái)源的Ⅱ型膠原蛋白產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞免疫。相關(guān)研究表明，對(duì)CIA誘導(dǎo)反應(yīng)敏感的大鼠比小鼠更早出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀，T細(xì)胞活化持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)使得炎癥發(fā)生率和嚴(yán)重程度更大[17]。

三、鏈球菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型

許多細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖成分已被證實(shí)具有促炎活性，可直接或間接刺激或調(diào)節(jié)免疫，誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物發(fā)生關(guān)節(jié)炎。針對(duì)鏈球菌細(xì)胞壁特異的抗體反應(yīng)以及軟骨和骨骼的破壞依賴于Toll樣受體(toll-like receptor,TLR4)通路，急性炎癥階段，鏈球菌也可以通過(guò)TLR2通路直接激活巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致針對(duì)鏈球菌片段的先天免疫反應(yīng)；在慢性期，鏈球菌首先啟動(dòng)特異性B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的發(fā)生，接著激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)[18]。

本模型在制備時(shí)將鏈球菌細(xì)胞壁成分肽聚糖多聚糖水懸液?jiǎn)为?dú)腹腔注射于易感品系體內(nèi)，24h 即出現(xiàn)急性期關(guān)節(jié)腫脹，2 周左右出現(xiàn)慢性炎性反應(yīng)，關(guān)節(jié)腫脹逐漸加重，至 4 周時(shí)趨于穩(wěn)定，并持續(xù)數(shù)月，成為嚴(yán)重的侵蝕性關(guān)節(jié)炎?，F(xiàn)研究認(rèn)為急性期是胸腺非依賴性的炎性反應(yīng)，而慢性期則是一種胸腺依賴性的特異性免疫應(yīng)答過(guò)程，并且這種特征性的波動(dòng)期與 RA 患者相似。這個(gè)慢性階段與在受累關(guān)節(jié)高水平的炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、金屬蛋白酶、循環(huán)氧化酶及氧化氮的產(chǎn)生有關(guān)[19]。鏈球菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(streptococcal cell wall arthritis, SCWIA)模型組織學(xué)和放射學(xué)結(jié)果顯示有一段時(shí)間的急性滲出期，隨后是侵蝕性滑膜炎，炎癥嚴(yán)重程度與T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的激活狀態(tài)有關(guān)。與人RA比較，該模型滑膜增殖、炎性細(xì)胞滲透、對(duì)稱關(guān)節(jié)受累和復(fù)發(fā)性炎癥表現(xiàn)相似，但該模型缺乏高滴度的類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor, RF)，而且沒(méi)有類風(fēng)濕結(jié)節(jié)的形成[20]。此外，該模型對(duì)治療人類RA的藥物金制劑和青霉素的反應(yīng)差。因此該模型用于研究RA仍有一定欠缺。

在動(dòng)物選擇方面，大鼠SCWIA模型的易感性與激素的分泌有關(guān)，其中雌性LEW大鼠的SCWIA發(fā)生率幾乎為100%，而雄性LEW大鼠、MHC相容雄性、雌性Fisher(F344/N)、WKY、BUF和其他品系相對(duì)耐藥，在暴露于鏈球菌細(xì)胞壁后不會(huì)發(fā)展為較嚴(yán)重的疾病[21]。小鼠SCWIA模型常用BALB/c、DBA/1品系小鼠在膝關(guān)節(jié)內(nèi)一次或多次注射鏈球菌細(xì)胞壁碎片使關(guān)節(jié)敏感，首先出現(xiàn)急性關(guān)節(jié)炎，1周內(nèi)痊愈，經(jīng)反復(fù)注射導(dǎo)致慢性關(guān)節(jié)炎。

四、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型

軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)是一種五聚體糖蛋白，主要存在于軟骨、肌腱、滑膜、氣管、半月板關(guān)節(jié)軟骨中，與軟骨蛋白結(jié)合的抗體存在于早期RA患者的血液和滑液中，因此利用該蛋白可誘發(fā)高發(fā)生率的嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎，同時(shí)伴有強(qiáng)烈的自身抗體反應(yīng)，并確保只涉及自身免疫過(guò)程[22]。

本模型在制備時(shí)用天然和變性的COMP在IFA(不完全弗氏佐劑)中免疫可誘導(dǎo)大鼠的嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎，溶解的COMP制劑用等量的IFA乳化，在大鼠尾巴底部進(jìn)行皮內(nèi)注射。在嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎的情況下，COMP在組織侵蝕期間從軟骨中釋放出來(lái)。這是COMP的一個(gè)有趣的特征，這使它成為RA中關(guān)節(jié)炎的生物學(xué)標(biāo)志物。慢性關(guān)節(jié)炎的大鼠在用低分子量佐劑降植烷的誘導(dǎo)下也會(huì)釋放COMP，血清中的水平與侵蝕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)[23]。與CIA模型比較，COMP誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型具有一定的優(yōu)勢(shì)，關(guān)節(jié)炎的發(fā)病是突然的，其特征是出現(xiàn)紅斑和前后爪腫脹。在腳趾關(guān)節(jié)遠(yuǎn)端觀察到關(guān)節(jié)炎，并在幾天內(nèi)同時(shí)在腳踝/腕關(guān)節(jié)發(fā)作。在嚴(yán)重的情況下，可以看到其擴(kuò)散到跖骨/掌骨區(qū)域以及關(guān)節(jié)和腳趾。

在動(dòng)物選擇方面，大鼠COMP誘發(fā)關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建時(shí)，主要易感品系是DA和LEW；COMP誘發(fā)小鼠關(guān)節(jié)炎模型時(shí)常用C57BL/6小鼠，發(fā)病與MCHⅡ類肽識(shí)別有關(guān)，T淋巴細(xì)胞對(duì)非自身COMP的反應(yīng)促進(jìn)了關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)[24]。與人RA比較，用COMP誘導(dǎo)的RA模型有利于研究關(guān)節(jié)炎的慢性發(fā)展和自身免疫反應(yīng)的表位擴(kuò)散和骨侵蝕，可作為研究關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的替代模型。

五、降植烷誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型

降植烷(pristane)誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎是通過(guò)刺激B淋巴細(xì)胞合成IgM、IgA型RF，同時(shí)RF與降植烷形成免疫復(fù)合物被吞噬細(xì)胞吞噬，轉(zhuǎn)變?yōu)檠仔约?xì)胞浸潤(rùn)滑膜，這種受到T淋巴細(xì)胞和MHC基因調(diào)節(jié)的慢性特異性關(guān)節(jié)炎的模式使得PIA模型成為研究炎癥性關(guān)節(jié)疾病機(jī)制的重要工具[25]。

本模型在制備時(shí)注射降植烷在動(dòng)物腹膜或皮內(nèi)，2～3周內(nèi)炎癥局限于關(guān)節(jié)，大鼠6～8周成為慢性復(fù)發(fā)性疾病；小鼠2～10個(gè)月才開(kāi)始發(fā)生關(guān)節(jié)炎癥。PIA模型造模過(guò)程雖然較長(zhǎng)，但關(guān)節(jié)炎癥呈慢性反復(fù)進(jìn)行性加重，病理變化包括滑膜增殖、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、骨膜炎、軟骨侵蝕和進(jìn)行性邊緣侵蝕，血清方面也可檢測(cè)到RF、抗熱休克蛋白抗體以及Ⅱ型膠原，這些改變與人RA較為接近，因此，該模型非常適合應(yīng)用于慢性復(fù)發(fā)炎癥的長(zhǎng)期研究以及治療干預(yù)，尤其是T淋巴細(xì)胞活化相關(guān)途徑導(dǎo)致的關(guān)節(jié)炎。

在動(dòng)物選擇方面，大鼠降植烷誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(pristane induced arthritis, PIA)模型常用LEW大鼠，發(fā)生率較高，紅腫最為明顯，但模型發(fā)病時(shí)間相對(duì)較晚，且不同的個(gè)體造模結(jié)果差異較大，但在急性期，血清還可檢測(cè)到RF和IL-6，與人RA十分相似，但炎癥消退后病情仍反復(fù)發(fā)作[26]。小鼠PIA模型常用BALB/c小鼠，以慢性發(fā)展為特點(diǎn)，關(guān)節(jié)炎癥腫脹程度較輕，一般經(jīng)初次注射后還需再次注射等量降植烷后，10天左右才出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，70天左右才能觀察到關(guān)節(jié)腫脹[27]。

需要說(shuō)明的是，每一種嚙齒類動(dòng)物RA模型在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)僅可模擬人RA疾病的一部分，并不能還原人RA發(fā)病的整個(gè)概況。模型的選擇取決于待研究疾病的階段和待解決的問(wèn)題。合適的動(dòng)物模型在構(gòu)建時(shí)需根據(jù)研究的目的、動(dòng)物的遺傳背景、刺激劑等方面進(jìn)行選擇，以保證動(dòng)物模型發(fā)病特點(diǎn)貼合研究目的，為RA的研究提供良好的實(shí)驗(yàn)工具。