佟振鵬，張星平，3*，閆德祺，王凱凱，么嵌巍，梁政亭

(1.新疆醫(yī)科大學，新疆 烏魯木齊 830017；2.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830099；3.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830017)

中醫(yī)在治療失眠方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗，文獻報道不論經(jīng)方、自擬方或其他傳統(tǒng)療法，總有效率都在80%以上，顯示出良好的臨床療效，且很好地彌補了現(xiàn)代醫(yī)學的不足[1]。但因醫(yī)家切入角度不同，對失眠辨證方法各異，如施今墨根據(jù)臨床常見癥狀，以病因而論將失眠分為10種證型[2]；林佳通過整理篩選《中華醫(yī)典》中確診為不寐的條目，發(fā)現(xiàn)至少有39個證型[3]。如此繁多的分型，使后學者掌握和重現(xiàn)良好療效較為困難。因此，探求一種實用客觀的中醫(yī)不寐分型方法顯得尤為必要。

我們團隊在“五神臟”理論及諸多醫(yī)家相關理論指導下，發(fā)現(xiàn)失眠癥狀雖然繁雜，但仔細分辨無非是以下5類：①睡眠輕淺易寤；②入寐維艱、難以入睡；③夢多、多夢；④思慮紛紜而影響睡眠；⑤夜寐早寤、睡眠早醒。而且發(fā)現(xiàn)僅依據(jù)這5類單一癥狀即可以明確對應肺、心、肝、脾、腎五臟定位診斷，我們將之稱為中醫(yī)不寐五神分型診斷法[4-5]。

在前期研究中，我們團隊完成了中醫(yī)不寐五神分型多導睡眠圖(Polysomnography,PSG)特征的研究，納入515例研究對象，其中肺不藏魄組94例，發(fā)現(xiàn)與正常組比較,肺不藏魄組的非快速動眼睡眠(non-rapid eye movement,NREM)N1期顯著高于正常組,其N2期與正常組無顯著性差異,N3期、快速動眼睡眠期(ra-pid eye movement,REM)顯著低于正常組[6]。這一特征作為以下肺不藏魄型失眠大鼠模型的評價標準。

多巴胺(Dopamine,DA)是一種重要的內(nèi)源性兒茶酚胺類物質(zhì)，目前研究認為DA在覺醒狀態(tài)中起著極其重要的作用[7-10]。多巴胺受體為七個跨膜區(qū)域(7-GM)組成的G蛋白偶聯(lián)受體家族，分有5個亞型，其中D1和D5亞型為D1樣受體，其作用機制主要通過升高細胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)作為第二信使通過激活PKA(cAMP依賴性蛋白激酶)，使靶細胞蛋白磷酸化，從而調(diào)節(jié)參與睡眠-覺醒過程。D2、D3和D4亞型為D2樣受體，通過降低細胞內(nèi)的cAMP在維持覺醒中發(fā)揮重要作用[11-12]。故選取多巴胺D1和D2受體進行肺不藏魄型失眠的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑及儀器

山羊抗兔多巴胺D1、D2多克隆抗體、免疫組化染色試劑盒(SP-0023，北京博奧森生物技術有限公司)；蘇木素伊紅染色液(北京雷根生物技術有限公司)；中性樹膠(北京博奧森生物技術有限公司)；DZF-6090真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；DM2500生物顯微鏡；Q550圖像處理系統(tǒng)(德國徠卡公司)；輪轉式石蠟切片機等。

1.1.2 實驗動物

采用鼠齡13～14周齡、體質(zhì)量(200±30)g的雄性SD大鼠16只，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2016-0003。實驗前適應性喂養(yǎng)3 d,自由攝食飲水、室溫(23±1)℃、相對濕度保持為30%～40%。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組

16只SD大鼠依據(jù)隨機數(shù)字表法分為對照組、失眠模型組，每組8只。

1.2.2 肺不藏魄型大鼠失眠模型建立

以小平臺水環(huán)境法(small platform water environment)[13]建立肺不藏魄型大鼠失眠模型，用有機玻璃制作30 cm×30 cm×35 cm的睡眠剝奪箱，其內(nèi)有一直徑為4.5 cm，高8.0 cm的平臺，水深2 cm，水溫(26±2)℃，以減少水溫變化對大鼠造成的環(huán)境應激。將睡眠剝奪組大鼠置于其中，在平臺上方8 cm處是食物以及飲用水槽，大鼠可自行攝食飲水，活動空間內(nèi)采用40 W的日光燈于08∶00—20∶00照射來模擬晝夜，室內(nèi)溫度維持在(23±1)℃，室內(nèi)相對濕度保持為30%～40%，剝奪箱上方有不銹鋼網(wǎng)罩。應用此法大鼠尚能進行NREM期睡眠，剝奪的主要是REM期睡眠，大鼠模型病理特征為缺乏REM期睡眠，也即睡眠表淺，這與我們前期研究中肺不藏魄型失眠患者的臨床表征睡眠輕淺易寤及PSG表現(xiàn)特征缺乏REM期睡眠基本吻合[4,6]，所以該原理大鼠動物模型可以作為中醫(yī)肺不藏魄型失眠動物模型。

對照組籠中飼養(yǎng)，不做任何干預處理，室溫、相對濕度、燈光與以上各組相同。

1.2.3 HE染色

使用蘇木素伊紅染色液對切片進行HE染色，石蠟切片經(jīng)2次二甲苯脫蠟，6次梯度酒精復水，蒸餾水沖洗，蘇木素液染核10～15 min，自來水沖洗片刻，1%鹽酸酒精分化3 s，立即流水沖洗，稀氨水溶液反藍1 min，流水沖洗，0.5%伊紅水溶液復染2～5 min，再次沖洗，通過6次梯度酒精脫水，2次二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組化染色

石蠟切片經(jīng)3次二甲苯，6次梯度酒精，蒸餾水沖洗，抗原修復液微波爐中修復，3%雙氧水孵育、山羊血清工作液封閉，滴加一抗孵育、二抗孵育、滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液孵育，DAB顯色鏡下觀察終止反應，蘇木素染核、氨水返藍，再經(jīng)梯度酒精二甲苯脫水，中性樹膠封片。

1.3 觀察指標

1.3.1 HE染色肺組織及腦組織病理形態(tài)

鏡下觀察肺組織中肺泡、肺間質(zhì)、肺毛細血管及腦組織中大腦皮層、海馬、下丘腦的病理形態(tài)變化并采集圖像。

1.3.2 免疫組化中各臟器多巴胺D1、D2受體表達水平

鏡下觀察每只大鼠肺、大腸、腦、心、肝、脾及腎組織，各組織均觀察5張切片，每張切片各取3個視野，應用image pro plus 6.0軟件計算平均光密度值(IOD/area)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 肺及腦的病理變化

失眠模型組在光鏡下見肺組織中肺泡壁毛細血管輕微擴張充血、纖維結締組織增生致使肺泡壁增厚、肺泡腔可見巨噬細胞，對照組肺組織光鏡下結果基本正常(圖1)。失眠模型組、對照組大鼠腦組織無血管擴張充血，血管周圍間隙未見增寬，無水腫，未見淋巴細胞、單核細胞浸潤。各腦區(qū)形態(tài)結構未見明顯異常(圖2)。

注：A.對照組；B.失眠模型組。圖1 兩組大鼠肺組織HE染色(200×)

注：A.對照組；B.失眠模型組。圖2 兩組大鼠海馬區(qū)HE染色(200×)

2.2 各臟器中D1、D2受體的表達

用SP法染出的免疫組織化學陽性反應產(chǎn)物呈黃褐色，失眠模型組大鼠可見D1受體大量分布于大腦皮層、海馬、下丘腦等處。皮層內(nèi)多巴胺受體D1陽性產(chǎn)物的分布最為密集；海馬內(nèi)可見多巴胺受體D1陽性產(chǎn)物清晰地分布在胞體和樹突上。而D2受體主要分布于海馬結構及顳葉內(nèi)側腦區(qū)。對照組多巴胺受體D1、D2陽性產(chǎn)物亦在皮層、海馬、紋狀體、蒼白球等部位見到分布。

在失眠模型組及對照組的肺中D1受體及D2受體均主要分布在呼吸道黏膜上皮及肺泡表面；心肌組織上主要是巴胺受體D1亞型，還存在少量D2亞型；結腸組織中結腸黏膜層、黏膜下層均有D1、D2受體分布，且主要以D2受體為主；在對照組腎臟中D2受體分布在腎小球及腎動脈周圍中；在兩組脾臟中均見D1及D2受體分布；肝臟中未見明顯D1、D2陽性反應物，見圖3。

圖3 各臟器中多巴胺D1、D2受體的分布(免疫組化染色，200×)

利用image pro plus 6.0軟件進行圖片分析得到IOD/Area數(shù)值，發(fā)現(xiàn)肺、腦、大腸、心中失眠模型組D1受體分布明顯高于對照組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；失眠模型組D2受體分布明顯低于對照組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；在脾臟、肝臟、腎臟中的分布數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、2。

表1 各臟器中多巴胺D1受體表達(IOD/Area)情況

表2 各臟器中多巴胺D2受體表達(IOD/Area)情況

3 討論

中醫(yī)的核心是五臟，而五臟藏五神，五神又是一個整體，并由心神統(tǒng)領，主管睡眠等精神活動。腦雖為元神之府，但隸屬于五臟，其生理病理與五臟密切相關。另中醫(yī)學認為肺與大腸相表里，經(jīng)脈相互絡屬，相互影響。故此次研究肺不藏魄型失眠選用大鼠肝、心、脾、肺、腎、腦與大腸來研究多巴胺D1、D2受體在其中的表達。

本實驗檢測D1、D2受體分布差異，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，失眠模型組腦組織中，D1受體表達明顯升高，D2受體表達明顯降低。D1受體參與多種信號傳導，包括Cs/cAMP/PKA通路，Golf/AC/PKA通路，Gq/PLC通路和電壓門控鈣離子通道，通過調(diào)節(jié)以上通路，D1受體升高導致覺醒狀態(tài)增多[14-15]。D2受體則抑制大腦皮層乙酰膽堿釋放，伏隔核多巴胺通過投射到基底前腦的GABA能神經(jīng)，控制膽堿能神經(jīng)元的興奮性[16-18]。D1、D2受體含量的變化導致了覺醒狀態(tài)的增多，進而導致失眠，說明肺不藏魄型失眠模型大鼠腦組織中D1受體表達明顯升高，D2受體表達明顯降低，這不僅是肺不藏魄型失眠模型大鼠腦組織中特征性神經(jīng)遞質(zhì)分布差異之一，而且也是肺不藏魄型失眠模型大鼠失眠的可能機制之一。

與對照組比較，肺不藏魄型失眠模型大鼠肺與大腸組織中D1受體表達明顯升高，D2受體表達明顯降低，HE染色觀察肺組織中肺泡壁毛細血管輕微擴張充血、纖維結締組織增生致使肺泡壁增厚、肺泡腔可見巨噬細胞，說明以上結果可能是肺不藏魄型失眠模型大鼠的特征性神經(jīng)遞質(zhì)分布差異及病理因素之一，其具體機制尚待進一步探討。中醫(yī)學理論認為肺為魄之宅，肺之精氣充盈，則肺魄得以安養(yǎng)，魄神藏于其舍而寐安，反之若有邪擾肺絡，肺之陰、陽、氣、血虧虛，或邪實壅肺等原因?qū)е路问C，肺主魄功能失常而不得臥[19-20]，正如《靈樞·淫邪發(fā)夢》曰：“魂魄飛揚，使人臥不得安而喜夢”。同時肺與大腸相表里，肺感病邪，宣發(fā)肅降失常，進而會影響大腸功能。

與對照組比較，肺不藏魄型失眠模型大鼠心臟組織中，多巴胺D1受體表達明顯升高，D2受體表達明顯降低，說明以上結果可能是該型失眠模型大鼠的特征性神經(jīng)遞質(zhì)分布差異之一，其具體的作用和調(diào)控機制尚待進一步研究和闡明。心為五臟六腑之大主，主神志，在精神活動中占有主導地位，睡眠是在心神的主導下，由五臟協(xié)作共同完成的?！端貑枴れ`蘭秘典論》曰：“心者，君主之官，神明出焉；肺者，相輔之官，治節(jié)出焉?！狈闻c心同居上焦，生理功能密切相關，肺對心主神明司睡眠也起到重要作用。肺朝百脈、主治節(jié)，助心行血。心血得暢，心有所養(yǎng)，則神志安定。若邪擾肺臟，心血阻滯，心失所養(yǎng)，則發(fā)失眠[21]。

總之，本實驗發(fā)現(xiàn)了肺不藏魄型失眠模型大鼠肺、大腸、腦、心臟組織中多巴胺D1受體表達明顯增加，D2受體表達明顯降低，說明D1受體表達增加，D2受體表達降低與肺不藏魄型失眠機制密切相關，是該型失眠模型的失眠機制之一，也是肺不藏魄型失眠模型大鼠的特征性神經(jīng)遞質(zhì)分布差異之一，本研究豐富和充實了中醫(yī)不寐五神分型法的理論和基礎，為臨床及科研服務。