沈永，郭利娟，薄曉文，孟凱

(山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101)

近年來，隨著人口老齡化的加深，糖尿病、高血壓患者越來越多，致使終末期腎病急劇增加，從而導(dǎo)致腎臟替代治療的需求持續(xù)增長［1-3］。血液透析、腹膜透析和腎臟移植是目前現(xiàn)有的腎臟替代療法，其中血液透析普遍應(yīng)用于腎臟替代治療［4］。血液透析是治療急、慢性腎功能衰竭和某些急性藥物、毒物中毒的有效方法［5］，主要是利用透析膜通過彌散及吸附等機(jī)理去除中小分子毒素，通過超濾和滲透清除體內(nèi)殘留過多的水分，達(dá)到血液凈化的目的［6］。血液透析器是血液透析系統(tǒng)的主要組成部分，通常由空心纖維(透析膜)、外殼、端蓋和醫(yī)用異氰酸酯密封膠組成。常見的高分子合成膜材料有聚砜、聚酰胺、醋酸纖維素等，其中聚砜膜具有優(yōu)良的生物相容性、良好的滲透性能等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)于血液透析器［7］。

聚砜膜的生產(chǎn)工藝通常采用浸沒沉淀相轉(zhuǎn)換法［8-10］。聚砜材料在N-甲基吡咯烷酮（NMP）中可形成均相溶液，聚砜溶液與非溶劑相互作用形成聚砜膜。據(jù)研究報(bào)道，NMP 具有刺激作用和潛在的生殖毒性，經(jīng)吸收后，以消化系統(tǒng)為主要的靶器官，還有可能影響中樞系統(tǒng)，從而影響人體機(jī)能［11-13］。血液透析器為三類高風(fēng)險(xiǎn)醫(yī)療器械，臨床使用時(shí)與患者血液直接接觸，故血液透析器中殘留的NMP 可能會(huì)遷移至患者血液，從而給患者造成較高的安全風(fēng)險(xiǎn)，所以需對(duì)血液透析器中NMP 溶出量進(jìn)行研究，以準(zhǔn)確評(píng)估血液透析器的安全性和有效性。

目前，在藥物、紡織品及食品包裝材料中NMP的主要檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法［14-16］。目前尚無高效液相色譜法測定血液透析器中NMP 溶出量的報(bào)道，且無相關(guān)的測試方法標(biāo)準(zhǔn)。筆者以超純水為替代溶劑，模擬臨床使用條件浸提血液透析器中NMP 的溶出量，采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、精密度及準(zhǔn)確度好，可測定血液透析器中NMP 的溶出量，以評(píng)估血液透析器中NMP 臨床接觸量，此外，該分析方法成本低，易于推廣，具有較好的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters Arc 型，沃特世科技（上海）有限公司。

滾壓泵：JHBP-2000 型，廣州市暨華醫(yī)療器械有限公司。

電子天平 XP205 型，感量為0.01mg，瑞士梅特勒托利多集團(tuán)。

pH 計(jì)：Seven Excellence 型，梅特勒-托利多（香港）控股有限公司。

數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：HH-8 型，常州國華電器有限公司。

超純水系統(tǒng)：Milli-Q A10 型，美國密理博公司。

NMP 對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.8%，批號(hào)為9C-11-23，廣州佳途科技股份有限公司。

甲醇、乙腈：色譜純，德國默克公司。

磷酸：優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由Milli-Q A10 型超純水系統(tǒng)制備。

血液透析器樣品：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.2 溶液配制

NMP 系列對(duì)照品工作溶液：精密稱取NMP 對(duì)照品54.19 mg 于50 mL 棕色容量瓶中，用超純水稀釋并定容至標(biāo)線，得質(zhì)量濃度為1.081 6 mg/mL的NMP 對(duì)照品儲(chǔ)備液，再用逐級(jí)稀釋法配制成NMP 的質(zhì)量濃度分別為0.054 08、0.108 2、0.216 3、0.540 8、1.08 2、2.163、5.408、10.82、21.63 μg/mL 的系列對(duì)照品工作溶液。

磷酸鹽緩沖溶液：精密稱取磷酸二氫鉀2.085 0 g、無水磷酸氫二鉀0.217 5 g 于1 L 容量瓶中，用超純水溶解、稀釋，加入磷酸1.0 mL，再用超純水定容至標(biāo)線。

1.3 色譜條件

色譜柱：XSelect?HSS T3 柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm，美國沃特世公司）；流量：0.5 mL/min；檢測波長：200 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：100 μL；流動(dòng)相：乙腈-磷酸鹽緩沖溶液（體積比為3∶97），洗脫方式：等度洗脫。

1.4 樣品處理

1.4.1 樣品供試液

（1）預(yù)沖。參照血液透析器臨床使用說明書，按照血液透析器預(yù)沖示意圖（圖1）所示連接血液透析器及硅膠管路，形成2 個(gè)分別獨(dú)立的循環(huán)系統(tǒng)，在玻璃燒杯中各加入1 000 mL 超純水，通過滾壓泵注滿整個(gè)閉路系統(tǒng)，以200 mL/min 的流速分別沖洗血液透析器血液側(cè)與透析液側(cè)，沖洗完畢后吹入氮?dú)馊コ和肝銎髦械囊后w。

圖1 血液透析器預(yù)沖示意圖

（2）浸提。按照血液透析器NMP 浸提示意圖（圖2）所示連接血液透析器及硅膠管路形成閉合循環(huán)系統(tǒng)，溶劑瓶中加入500 mL 水，通過滾壓泵在（37±1） ℃下以200 mL/min 的流量循環(huán)5 h，循環(huán)完畢后將硅膠管路及血液透析器中浸提液轉(zhuǎn)移至溶劑瓶，溶劑瓶中加入水至溶液體積為600 mL，即得樣品供試液。

圖2 血液透析器NMP 浸提示意圖

1.4.2 空白對(duì)照液

移取500 mL 水于溶劑瓶中，采用硅膠管形成閉合循環(huán)回路，通過滾壓泵在（37±1） ℃下以200 mL/min 的流量循環(huán)5 h，將循環(huán)管路中水轉(zhuǎn)移至溶劑瓶，溶劑瓶中加入水至溶液體積為600 mL，即得空白對(duì)照液。分別取樣品供試液、空白對(duì)照液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

甲醇、乙腈、水、緩沖鹽為高效液相色譜常用流動(dòng)相，磷酸緩沖鹽有助于改善色譜峰峰形，乙腈的紫外截止吸收波長較甲醇低，故選乙腈與磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相。NMP 紫外最大吸收波長為200 nm，故選用200 nm 為檢測波長。NMP 極性較大，在色譜柱保留較弱，故選用XSelect?HSS T3 極性色譜柱為分析柱，以增強(qiáng)NMP 在色譜柱的保留。

2.2 浸提方式與浸提溶劑的選擇

血液透析器在臨床應(yīng)用時(shí)，血液側(cè)與人體直接接觸，透析液側(cè)與人體間接接觸。血液透析器為三類高風(fēng)險(xiǎn)醫(yī)療器械，故因此將血液透析器的血液側(cè)與透析液側(cè)連接形成閉合回路進(jìn)行循環(huán)制備樣品供試液。NMP 易溶于水、乙醇、乙醚、丙酮等溶劑，考慮到血液透析器組成材料的耐受性以及經(jīng)濟(jì)環(huán)保等因素，選取超純水為浸提溶劑，以減少非目標(biāo)化合物干擾。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取適量空白對(duì)照液、NMP 對(duì)照品溶液及樣品供試液，按1.3 色譜條件分別測定，高效液相色譜圖見圖3。由圖3 可知，NMP 對(duì)照品溶液的保留時(shí)間約為7.8 min，樣品供試液中NMP 的保留時(shí)間與空白對(duì)照溶液基本一致，NMP 色譜峰峰形良好，與鄰近色譜峰分離度均大于1.5，空白對(duì)照液對(duì)分析測定無干擾，滿足試驗(yàn)要求，表明該方法專屬性良好。

圖3 高效液相色譜圖

2.4 線性方程與檢出限

取NMP 系列對(duì)照品工作溶液，按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，以NMP 的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得NMP 的線性方程為y=807 374x+47 765，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，表明NMP 的質(zhì)量濃度在0.054 08～21.63 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好。

用超純水對(duì)1.2 配制的NMP 對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋并按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，根據(jù)《中國藥典》2020 版9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中信噪比法測定NMP 的檢出限和定量限［17］。當(dāng)NMP 的質(zhì)量濃度為0.027 04 μg/mL 時(shí)，信噪比約為3；當(dāng)NMP 的質(zhì)量濃度為0.054 08 μg/mL 時(shí)，信噪比約為10，故該方法NMP 的檢出限與定量限分別為0.027 04、0.054 08 μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

移取質(zhì)量濃度分別為0.054 08、0.540 8、5.408 μg/mL 的NMP 對(duì)照品溶液，按照1.3 色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1 可知，3 個(gè)濃度水平6 次測定峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.086%～1.332%，表明該方法的精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取適量樣品供試液，精密加入對(duì)照品溶液，制成低、中、高3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)供試溶液，各平行制備3 份，按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2 可知，NMP 3 個(gè)濃度水平的平均回收率為93.12%～95.13%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，滿足《中國藥典》2020 版藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中的規(guī)定。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品測定

選取4 套血液透析器樣品，按照1.4 方法分別制備樣品供試液（編號(hào)分別為1#、2#、3#、4#），采用1.3色譜條件測定樣品供試液中NMP 的含量，結(jié)合樣品供試液制備方法，計(jì)算NMP 臨床接觸量，測定結(jié)果見表3。由表3 可知，單套血液透析器樣品中NMP 最大臨床接觸量為446.36 μg。根據(jù)GB/T 16886.17—2005 《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第17部分：可瀝濾物允許限量的建立》對(duì)血液透析器中NMP允許限量進(jìn)行評(píng)估，血液透析器中NMP 的測定值在允許限量范圍內(nèi)［18］。

表3 血液透析器中NMP 含量及臨床接觸量測定結(jié)果

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜法測定血液透析器中N-甲基吡咯烷酮溶出量的分析方法，該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、精密度及準(zhǔn)確度良好。采用該分析方法測定血液透析器中NMP 溶出量，以評(píng)估血液透析器中NMP 臨床接觸量，可用于血液透析器安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為產(chǎn)品生產(chǎn)工藝控制提供參考，以及為監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。