王秀麗 陸晨紅 霍俊輝 范寶瑩 孫健

摘 要：以接種復(fù)配發(fā)酵劑作為實(shí)驗組，以自然發(fā)酵作為對照組，通過測定pH值、色差、質(zhì)構(gòu)、亞硝酸鹽含量等理化指標(biāo)探究接種發(fā)酵對牛肉發(fā)酵香腸品質(zhì)的影響;通過提取香腸多肽并測定多肽的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2，2-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）陽離子自由基、羥自由基清除能力，探究接種發(fā)酵對香腸中多肽抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：牛肉發(fā)酵香腸在發(fā)酵成熟過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，其pH值、亮度顯著下降

（P<0.05），亞硝酸鹽殘留量顯著減少到國標(biāo)允許范圍內(nèi)（P<0.05），實(shí)驗組的pH值在發(fā)酵21 d時顯著低于對照組（P<0.05），硬度、彈性、咀嚼性顯著高于對照組（P<0.05）;多肽含量測定結(jié)果與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，接種復(fù)配發(fā)酵劑使得香腸多肽含量增加，ABTS陽離子自由基、DPPH自由基清除活性顯著提高（P<0.05）。因此，接種復(fù)配發(fā)酵劑發(fā)酵對牛肉發(fā)酵香腸的品質(zhì)有很大改善，也提高了多肽含量及其抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：牛肉發(fā)酵香腸;接種發(fā)酵;品質(zhì);多肽;抗氧化活性;植物乳桿菌;模仿葡萄球菌

Effects of Inoculated Fermentation on Quality of Fermented Beef Sausage and Antioxidant Activity of Peptides from It

WANG Xiuli， LU Chenhong， HUO Junhui， FAN Baoying， SUN Jian*

（National Center for Meat Quality and Safety Control， College of Food Science and Technology，

Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： The present study aimed to explore the effect of inoculated fermentation on the quality of fermented beef sausage. A mixed culture was used to prepare fermented beef sausage， and naturally fermented sausage was also prepared as a control. The quality of fermented sausage was evaluated by measuring its physicochemical parameters such as pH， color， texture and nitrite residue. Furthermore， the antioxidant activity of peptides in fermented sausages were investigated by measuring their scavenging capacities against 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical， 2，2-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） （ABTS） cation radical and hydroxyl radicals. The results showed that the pH and brightness of fermented beef sausages decreased significantly with fermentation time （P < 0.05）. Nitrite residue was significantly reduced to be within the allowable range of the national standard （P < 0.05）. On the 21st day， the pH of inoculated fermented sausage was significantly lower than that of the control group （P < 0.05）， while the opposite was observed for hardness， springiness and chewiness （P < 0.05）. The results of peptide measurement and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis （SDS-PAGE） showed that compared to the control group， the peptide content of inoculated fermented sausage increased， and so did the ABTS cation radical and DPPH radical scavenging activities of peptides （P < 0.05）. Therefore， the quality of fermented beef sausage was greatly improved by inoculation with the mixed starter， and the polypeptide content and antioxidant activity were also increased.

Keywords： fermented beef sausages; inoculated fermentation; quality; polypeptide; antioxidant activity; Lactobacillus plantarum; Staphylococcus simulans

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210817-202

中圖分類號：TS251.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2022）01-0007-07

引文格式：

王秀麗， 陸晨紅， 霍俊輝， 等. 接種發(fā)酵對牛肉發(fā)酵香腸品質(zhì)及多肽抗氧化活性的影響[J]. 肉類研究， 2022， 36（1）： 7-13. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210817-202.? ? http：//www.rlyj.net.cn

WANG Xiuli， LU Chenhong， HUO Junhui， et al. Effects of inoculated fermentation on quality of fermented beef sausage and antioxidant activity of peptides from it[J]. Meat Research， 2022， 36（1）： 7-13. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210817-202.

http：//www.rlyj.net.cn

發(fā)酵香腸是指將肉連同脂肪絞碎，加入配料、發(fā)酵劑一起灌入腸衣，經(jīng)微生物發(fā)酵后制成的肉制品[1]。發(fā)酵香腸含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，風(fēng)味獨(dú)特、安全性高，是發(fā)酵肉制品的典型代表[2]。我國作為肉制品消費(fèi)大國，牛肉消費(fèi)占比巨大，加之少數(shù)民族和西方餐飲習(xí)慣的影響也讓牛肉的需求空間更大，因此牛肉發(fā)酵香腸具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

在發(fā)酵香腸加工過程中，脂肪降解在風(fēng)味形成上有重要貢獻(xiàn)。然而在實(shí)際生產(chǎn)和流通中，脂肪和蛋白質(zhì)過度氧化酸敗，使得發(fā)酵香腸失去原有風(fēng)味，降低食用價值和營養(yǎng)價值，嚴(yán)重時會對人體產(chǎn)生不利影響[3-4]。目前，針對發(fā)酵香腸抗氧化穩(wěn)定性的提高，國內(nèi)外研究人員在加工工藝、原輔料、抗氧化劑及包裝等方面成果較為顯著[3]，但仍有不足之處，且很難多方面滿足發(fā)酵香腸的風(fēng)味、品質(zhì)、營養(yǎng)、安全等的需求。

發(fā)酵劑是指能在發(fā)酵基質(zhì)中發(fā)揮理想代謝活性的活的或休眠狀態(tài)的微生物制劑[5]。常見的肉品發(fā)酵劑微生物主要是乳酸菌、酵母菌、霉菌及葡萄球菌的一些菌株[2，6]，它們在原料肉中的代謝活動對發(fā)酵香腸獨(dú)特品質(zhì)的形成具有重要意義[2]。同時，一些菌株可以產(chǎn)生有機(jī)酸或細(xì)菌素[7]，抑制有害微生物的生長，提升產(chǎn)品的安全性和穩(wěn)定性[8-9]。并且一些發(fā)酵劑已被證明有助于形成具有抗氧化、抗高血壓和降膽固醇功能的低分子質(zhì)量化合物，如肽。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，動植物蛋白源肽顯示出良好的抗氧化活性。但是，天然抗氧化肽本身的提取步驟相當(dāng)繁瑣，在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用還停留在實(shí)驗研究階段。因此，研究發(fā)酵劑對于香腸內(nèi)源性抗氧化肽的影響具有重要意義。曹辰辰等[4]研究復(fù)配發(fā)酵劑對豬肉發(fā)酵香腸品質(zhì)的影響，但未研究該復(fù)配發(fā)酵劑對于牛肉發(fā)酵香腸品質(zhì)及多肽抗氧化性的影響。因此，本研究將植物乳桿菌CD101（Lactobacillus plantarum CD101）和模仿葡萄球菌NJ201（Staphylococcus simulans NJ201）作為發(fā)酵劑接種到牛肉發(fā)酵香腸中，以自然發(fā)酵香腸作為對照組，探究發(fā)酵劑對牛肉發(fā)酵香腸品質(zhì)及多肽抗氧化活性影響，為提升牛肉發(fā)酵香腸的產(chǎn)品品質(zhì)、營養(yǎng)性、安全性及抗氧化性等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛肉、豬背膘、豬腸衣、調(diào)味料 江蘇南京蘇果超市。

植物乳桿菌CD101（NCBI編號為MG798695）、模仿葡萄球菌NJ201（NCBI編號為MG798688），由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心實(shí)驗室保存。

MRS培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基 青島海博生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、氯化鈉、氯化亞鐵 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;食品中亞硝酸鹽含量檢測試劑盒、羥自由基清除能力檢測試劑盒? ?南京輝亞生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒? ?南京格雷福斯生物科技有限公司;總抗氧化能力測試試劑盒 南京邁博昊成生物科技有限公司;試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TC 12E絞肉機(jī) 意大利Sirman公司;VF608灌腸機(jī)?德國Handtmann公司;FE20 pH計 美國Mettler Toledo公司;TA-XT2質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司;CR-400色差儀 日本Konica Minota公司;PowerPac Basic電泳儀、Universal Hook凝膠成像儀?美國Bio-Rad公司;Spectral Max M2e多功能酶標(biāo)儀?美國MD公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑的活化與制備

根據(jù)Yu Di等[10]的方法稍作修改。挑取MRS平板上的植物乳桿菌CD101于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h;挑取TSA平板上的模仿葡萄球菌NJ201于TSA液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)18 h;分別活化3 次后，菌液12 000×g、4 ℃離心（5 min），棄上清液，用無菌水洗滌沉淀3 次，備用。

1.3.2 牛肉發(fā)酵香腸的制作

參考馮美琴等[11]的方法進(jìn)行制作。新鮮牛肉與豬背膘質(zhì)量比為8∶2，以肉質(zhì)量為基礎(chǔ)添加：食鹽2%、蔗糖1%、葡萄糖1%、亞硝酸鈉0.015%、異抗壞血酸鈉0.05%、姜粉0.1%、白胡椒粉0.1%、五香粉0.1%。設(shè)置2 個處理組：以自然發(fā)酵處理組為對照組，以添加接種量為107 CFU/g且菌株配比為植物乳桿菌CD101∶模仿葡萄球菌NJ201=1∶1的復(fù)配發(fā)酵劑處理組作為實(shí)驗組。

工藝流程：原料肉→漂洗→絞肉→攪拌（分批加入發(fā)酵劑和其他輔料）→灌腸→恒溫發(fā)酵→干燥成熟。

工藝條件：30 ℃、相對濕度80%條件下發(fā)酵24 h，15 ℃、相對濕度75%條件下緩慢發(fā)酵3 d，最后以12 ℃、相對濕度72%進(jìn)行干燥，在第21天時得到發(fā)酵香腸成品。

1.3.3 牛肉發(fā)酵香腸pH值測定

按照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[12]，使用pH計進(jìn)行測定。

1.3.4 牛肉發(fā)酵香腸色差測定

根據(jù)Cao Chenchen等[13]的方法并稍作修改。剝?nèi)ハ隳c樣品腸衣，絞碎，按壓成厚約1 cm、半徑1 cm的薄片，選6 個不同位置，使用色差儀測定樣品的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。

使用前用標(biāo)準(zhǔn)版Y=94.0、X=0.315 6、y=0.332 1校正。引用E*評價香腸的色澤以減少誤差，E*按式（1）計算。

（1）

1.3.5 牛肉發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)測定

根據(jù)Cao Chenchen等[13]的方法并稍作修改。香腸剝?nèi)ツc衣，切成高25 mm、半徑約10 mm大小，使用P/50A探頭，參數(shù)設(shè)定為：50 kg load cell，測前速率2 mm/s，測試速率5 mm/s，測后速率5 mm/s，壓縮率50%。取硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性4 個指標(biāo)作為測定結(jié)果。

1.3.6 牛肉發(fā)酵香腸亞硝酸鹽含量測定

采用亞硝酸鹽含量檢測試劑盒測定。

1.3.7 牛肉發(fā)酵香腸中粗肽的提取

參照馮美琴等[11]的方法并稍作修改。選擇未接菌和接菌發(fā)酵香腸各3 根，每根稱取25 g，去除肥丁、腸衣和筋膜后絞肉機(jī)切碎斬勻的香腸碎末，加入100 mL 0.1 mol/L、pH 7.2 PBS后，冰浴勻漿4 次（15 000 r/min，每次15 s），4 ℃靜置2 h后，離心（4 ℃、12 000×g、22 min），用8 層紗布過濾取上清液，加3 倍體積40%乙醇，靜置12 h，再次離心（4 ℃、12 000×g、22 min），抽濾取上清液，旋蒸（50 r/min、40 ℃）所有樣品后得到濃縮的肽液，使用凍干機(jī)冷凍干燥60 h得到粗肽粉，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8 牛肉發(fā)酵香腸粗肽粉多肽含量測定

根據(jù)Yu Di等[10]的方法并稍作修改，用鄰苯二甲醛（ortho-phthalaldehyde，OPA）法測定。OPA混合試劑的配制：80 mg OPA溶于2 mL甲醇，依次加入50 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液、5 mL 20 g/100 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和200 μL β-巰基乙醇，用去離子水定容至100 mL。取100 μL去離子水配制的1 mg/mL粗肽溶液，加入2.0 mL OPA混合試劑，劇烈混勻，室溫孵育2 min，測定反應(yīng)液在340 nm波長處吸光度。胰酪蛋白胨作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，配制一系列質(zhì)量濃度（0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）溶液，在340 nm波長處測定吸光度，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出反應(yīng)液中多肽質(zhì)量濃度，粗肽粉中多肽含量按式（2）計算。

（2）

1.3.9 牛肉發(fā)酵香腸蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）

根據(jù)Yu Di等[10]的方法并稍作修改。取4 g去肥絞碎香腸加入16 mL全蛋白提取液（2 g/100 mL SDS溶于0.01 mol/L、pH 7.0 PBS）;9 500 r/min冰浴勻漿2×30 s后，4 ℃、4 000×g離心20 min，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清液的蛋白質(zhì)量濃度。用超純水調(diào)節(jié)上清液蛋白質(zhì)量濃度至1 mg/mL，與5×上樣緩沖液充分混合（4∶1，V/V），沸水浴5 min，快速冷卻至室溫。用10%的預(yù)制膠，樣品上樣量10 μL，標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣量5 μL進(jìn)行電泳，80 V運(yùn)行30 min后，調(diào)節(jié)電壓為120 V電泳1 h。電泳結(jié)束后，染色1 h、脫色18 h，于成像系統(tǒng)觀察。

1.3.10 牛肉發(fā)酵香腸多肽1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定

根據(jù)Yu Di等[10]的方法并稍作修改。DPPH自由基溶液（0.2 mmol/L，溶于95%乙醇）與0.5 mL肽液混合作為樣品組;DPPH自由基溶液與0.5 mL 95%乙醇混合作為空白組;95%乙醇與0.5 mL肽液混合作為對照組。3 組混合溶液室溫避光反應(yīng)30 min后，5 000 r/min離心5 min，在517 nm波長處測定上清液吸光度，以1 mg/mL GSH作為陽性對照。DPPH自由基清除率按式（3）計算。

（3）

式中：A樣品為樣品組的吸光度;A空白為空白組的吸光度;A對照為對照組的吸光度。

1.3.11 牛肉發(fā)酵香腸多肽羥自由基清除能力測定

采用羥自由基清除能力檢測試劑盒測定。

1.3.12 牛肉發(fā)酵香腸多肽2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2，2-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）陽離子自由基清除能力測定

采用總抗氧化能力測試試劑盒（ABTS法）測定。

ABTS陽離子自由基清除能力用Trolox當(dāng)量表示，單位為μmol/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SAS 9.1軟件中的Duncans Multiple-Range Test進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，

P<0.01表示差異極顯著，采用Factorial ANOVA進(jìn)行方差分析，使用Origin 7.0繪圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉發(fā)酵香腸pH值測定結(jié)果

由表1可知，發(fā)酵0 d的香腸pH值在5.53左右，自然發(fā)酵組與復(fù)配發(fā)酵組無顯著差異，發(fā)酵21 d的香腸pH值均顯著低于0 d（P<0.05），且復(fù)配發(fā)酵組顯著低于自然發(fā)酵組（P<0.05）。此結(jié)果與Yu Di等[10]的研究一致，說明復(fù)配發(fā)酵組的乳酸菌具有較強(qiáng)產(chǎn)酸能力。

Zhao Lihua等[14]研究認(rèn)為發(fā)酵過程中合適的溫度和濕度有利于乳酸菌的生長，促進(jìn)其積累有機(jī)酸，尤其是乳酸。低pH值可抑制有害微生物生長，保證產(chǎn)品的食用安全性[9]。此外，Kanno等[15]研究表明，低pH值能降低肉中蛋白質(zhì)的持水能力，縮短香腸的發(fā)酵周期。

2.2 牛肉發(fā)酵香腸色差測定結(jié)果

由表2可知：L*、E*受發(fā)酵時間、不同發(fā)酵處理作用影響顯著（P<0.05）;發(fā)酵21 d香腸的L*降低，E*升高。dos Santos Cruxen等[16]通過實(shí)驗證實(shí)添加木糖葡萄球菌LQ3的香腸顏色比不添加的香腸顏色更紅，具有更好的感官品質(zhì)。Cao Chenchen等[13]的研究表明，復(fù)配發(fā)酵香腸pH值較低，促進(jìn)了亞硝酸鹽分解為NO，進(jìn)而生成亞硝基肌紅蛋白，從而改善了產(chǎn)品的色澤[17]。

2.3 牛肉發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果

質(zhì)構(gòu)特性是發(fā)酵香腸品質(zhì)的重要特征，優(yōu)良的香腸應(yīng)當(dāng)硬度適中、腸體堅實(shí)有彈性、質(zhì)地緊密。由表3可知，復(fù)配發(fā)酵組香腸的硬度、彈性顯著高于自然發(fā)酵組（P<0.05），表明接種發(fā)酵劑能顯著提升產(chǎn)品的硬度和彈性，這與Essid等[18]的研究結(jié)果一致，該研究表明，使用植物乳桿菌和模仿葡萄球菌復(fù)合發(fā)酵顯著提升了發(fā)酵香腸的硬度和彈性，提升產(chǎn)品品質(zhì)。此外，復(fù)配發(fā)酵組香腸的咀嚼性顯著高于自然發(fā)酵組，這表明接種發(fā)酵劑也可以改善香腸的咀嚼性，但2 組的黏聚性差異不顯著，這與曹辰辰[19]的研究結(jié)果相一致。

2.4 牛肉發(fā)酵香腸亞硝酸鹽含量測定結(jié)果

大寫字母不同，表示發(fā)酵相同時間的不同處理組間差異顯著（P<0.05）;小寫字母不同，表示相同處理組、不同發(fā)酵時間差異顯著（P<0.05）。

由圖1可知，亞硝酸鹽殘留量受發(fā)酵時間的影響極顯著（P<0.01），而其受不同發(fā)酵處理的影響不顯著。2 組發(fā)酵香腸發(fā)酵21 d時亞硝酸鹽殘留量都較0 d顯著降低，發(fā)酵21 d時復(fù)配發(fā)酵組和自然發(fā)酵組的牛肉香腸中亞硝酸鹽含量分別為0.95、1.00 mg/kg。此結(jié)果與曹辰辰等[4]的研究一致，發(fā)酵21 d時的發(fā)酵香腸中亞硝酸鹽含量極低，并且遠(yuǎn)低于熟肉制品最大允許量30 mg/kg的國家標(biāo)準(zhǔn)[20]。

2.5 牛肉發(fā)酵香腸粗肽粉多肽含量測定結(jié)果

由表4可知，接種發(fā)酵劑后，粗肽粉肽含量從26.31%提高至28.49%，此結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果中15 kDa的條帶增強(qiáng)相吻合，與Yu Di等[10]的結(jié)論相同，該研究認(rèn)為在加工過程中，大分子質(zhì)量多肽含量降低，小分子質(zhì)量多肽含量增加;接種發(fā)酵劑能促進(jìn)多肽含量增加，尤其是分子質(zhì)量較小的多肽含量。依據(jù)樊康[21]的研究，在發(fā)酵香腸成熟前期，主要是香腸內(nèi)源蛋白酶起作用，而在成熟后期，主要是微生物酶降解小肽。由于復(fù)配發(fā)酵組的微生物酶降解肽成小分子肽的能力較自然發(fā)酵組中微生物酶的能力更強(qiáng)，所以復(fù)配發(fā)酵組的肽含量要高于自然發(fā)酵組。

活性肽具有清除自由基、螯合金屬離子的作用，可廣泛抑制由金屬離子、酶、單線態(tài)氧所誘發(fā)的氧化反應(yīng)[3]。因此，肽含量的變化將直接影響自然發(fā)酵組和復(fù)配發(fā)酵組牛肉發(fā)酵香腸的其他抗氧化能力，如DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、羥自由基清除能力等。

2.6 SDS-PAGE結(jié)果

a.發(fā)酵0 d;b. 21 d自然發(fā)酵組;c. 21 d復(fù)配發(fā)酵組。

蛋白質(zhì)降解是發(fā)酵香腸成熟過程中最重要的生化反應(yīng)之一，參與這一過程的蛋白酶主要為內(nèi)源蛋白酶及微生物蛋白酶。220、45、40、37 kDa分別對應(yīng)肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白[11]。由圖2可知，發(fā)酵0 d香腸蛋白中高分子質(zhì)量的條帶較多且顏色較深。與發(fā)酵0 d相比，發(fā)酵21 d復(fù)配發(fā)酵組與自然發(fā)酵組均幾乎無95～270 kDa高分子質(zhì)量條帶，表明肌球蛋白重鏈強(qiáng)烈降解，這是肌肉內(nèi)源酶作用的結(jié)果。

陳倩等[22]指出，在發(fā)酵初期，肌肉內(nèi)源酶會將蛋白質(zhì)降解成多肽，繼而內(nèi)源性氨肽酶可以將多肽進(jìn)一步降解成小肽及游離氨基酸。此外，復(fù)配發(fā)酵組與自然發(fā)酵組相比，30～50 kDa條帶幾乎消失，這表明發(fā)酵劑加強(qiáng)了肌動蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白的降解，接種微生物促進(jìn)了內(nèi)源蛋白酶的活性，從而促進(jìn)了蛋白降解[11];

同時，接種微生物也引入了較多的微生物蛋白酶，這2 種因素共同作用，導(dǎo)致蛋白降解程度的加深。15 kDa以下的條帶顏色變深，可能是小分子肽和游離氨基酸的產(chǎn)生引發(fā)的累積，復(fù)配發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中蛋白質(zhì)降解和小分子肽積累具有有效性，增加了多肽尤其是小分子多肽的含量。以上結(jié)果均與馮美琴等[11]的研究結(jié)果相似。

2.7 牛肉發(fā)酵香腸多肽DPPH自由基清除能力測定結(jié)果

當(dāng)DPPH自由基與抗氧化劑相遇時，可以接受抗氧化劑的氫原子，導(dǎo)致其在517 nm波長處的吸光度下降，其變化程度與抗氧化劑的含量呈劑量關(guān)系[23]。因此多肽DPPH自由基清除能力可以作為抗氧化指標(biāo)，反映香腸的抗氧化能力。

實(shí)驗中1 mg/mL GSH的DPPH自由基清除率為95.64%，與Yu Di等[10]的結(jié)果相似。GSH組的DPPH自由基清除率均高于自然發(fā)酵組和復(fù)配發(fā)酵組，可驗證自然發(fā)酵組和復(fù)配發(fā)酵組具有DPPH自由基清除能力。復(fù)配發(fā)酵組的DPPH自由基清除能力約為GSH組的1/3，自然發(fā)酵組的DPPH自由基清除能力約為GSH組的1/5。

大寫字母不同，表示相同質(zhì)量濃度、不同處理組間差異顯著（P<0.05）;小寫字母不同，表示相同處理組、不同質(zhì)量濃度間差異顯著（P<0.05）。圖4同。

由圖3可知，2 組牛肉發(fā)酵香腸多肽DPPH自由基清除率受質(zhì)量濃度和發(fā)酵處理因素的影響均顯著

（P<0.05），復(fù)配發(fā)酵組DPPH自由基清除率顯著高于自然發(fā)酵組（P<0.05），且2 組DPPH自由基清除率呈上升趨勢。這表明接種發(fā)酵劑能顯著增強(qiáng)小分子多肽清除DPPH自由基的能力。與Yu Di等[10]的研究結(jié)果相同。

Mejri等[24]發(fā)現(xiàn)，接種戊糖乳桿菌等菌種制作發(fā)酵香腸，能夠促進(jìn)香腸中產(chǎn)生抗氧化肽，從而使香腸具有良好的DPPH自由基清除能力。多肽的抗氧化活性與多肽的氨基酸組成、空間結(jié)構(gòu)和疏水性有關(guān)，一些獨(dú)特的氨基酸序列可能具有較強(qiáng)的抑制或阻斷氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的

能力[25]。例如，Liu Dongmei等[26]指出，位于N端的疏水性氨基酸有利于提高多肽的抗氧化活性。由于DPPH自由基是一種穩(wěn)定的親脂性自由基，所以復(fù)配發(fā)酵組香腸中多肽DPPH自由基清除活性高說明復(fù)配發(fā)酵劑中微生物蛋白酶水解蛋白時暴露出更多疏水性氨基酸，使其更容易與DPPH自由基結(jié)合而發(fā)揮作用[10]。

2.8 牛肉發(fā)酵香腸多肽羥自由基清除能力測定結(jié)果

羥自由基是目前已知對生物體危害最大的一種自由基，可對糖類、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等生物大分子造成氧化損傷[27]。由圖4可知，在0.2、0.4 mg/mL質(zhì)量濃度條件下，3 組羥自由基清除率無顯著差異，但質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL時，復(fù)配發(fā)酵組香腸與其他2 組相比開始出現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。GSH組、自然發(fā)酵組的羥自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加并未表現(xiàn)出明顯差異，而復(fù)配發(fā)酵組的羥自由基清除率卻在大于0.4 mg/mL時呈現(xiàn)出顯著下降（P<0.05）。

結(jié)果表明，復(fù)配發(fā)酵組香腸粗肽的羥自由基清除能力在質(zhì)量濃度較高時顯著低于自然發(fā)酵組，且隨著質(zhì)量濃度的增加，清除能力顯著下降，與Yu Di等[10]的研究結(jié)果不符，該研究表明，發(fā)酵香腸中對羥自由基清除能力較好的為分子質(zhì)量較大的多肽，小分子多肽的羥自由基清除能力顯著下降。Zhu Chaozhi等[28]在金華火腿粗肽液分離過程中也發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量最小的組分羥自由基清除率最低，這可能是由于這些組分通常含有大量的氨基酸并且一些寡肽的抗氧化能力較弱。根據(jù)Chen Huiping等[29]

報道，當(dāng)多肽被水解為游離氨基酸時，其抗氧化能力可能會降低或完全消失。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，復(fù)配發(fā)酵組蛋白質(zhì)降解程度較重，小分子肽含量增加，這可能是導(dǎo)致羥自由基清除能力下降的原因。

2.9 牛肉發(fā)酵香腸多肽ABTS陽離子自由基清除能力

測定結(jié)果

ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS陽離子自由基，在抗氧化物存在時ABTS陽離子自由基的產(chǎn)生受到抑制，在734 nm波長處吸光度會下降[2]。由表5可知，復(fù)配發(fā)酵組香腸的ABTS陽離子自由基清除能力顯著高于自然發(fā)酵組（P<0.05），同時GSH組的ABTS陽離子自由基清除能力為771.00 ?mol/g，與自然發(fā)酵組和復(fù)配發(fā)酵組均有顯著差異（P<0.05）。以上結(jié)果說明，復(fù)配發(fā)酵劑在加工過程中能顯著增強(qiáng)多肽的ABTS陽離子自由基清除能力，提高發(fā)酵香腸中抗氧化肽的抗氧化活性。這與Yu Di等[10]的結(jié)論相似，其結(jié)果表明，接種復(fù)配發(fā)酵劑能在加工過程中顯著增強(qiáng)小分子多肽的ABTS陽離子自由基清除能力。同時，Luan Xiaoxu等[30]表明，接種發(fā)酵組中低分子質(zhì)量、高疏水氨基酸比例的短鏈肽含量更高，因而抗氧化活性更強(qiáng)。該指標(biāo)的測定結(jié)果也與肽含量測定結(jié)果相符，進(jìn)一步證明了復(fù)配發(fā)酵劑通過提高具有抗氧化功能的小分子多肽含量增強(qiáng)牛肉發(fā)酵香腸的ABTS陽離子自由基清除能力。

3 結(jié) 論

本研究探究發(fā)酵劑對牛肉發(fā)酵香腸品質(zhì)及多肽抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：接種發(fā)酵劑能顯著提高香腸的硬度、彈性和咀嚼性等，改善產(chǎn)品色澤，提升產(chǎn)品品質(zhì);發(fā)酵21 d時亞硝酸鹽含量明顯下降，且含量在國標(biāo)允許范圍內(nèi)，保證了香腸的安全性;肽含量測定及

SDS-PAGE結(jié)果表明，復(fù)配發(fā)酵劑有效促進(jìn)蛋白降解成分子質(zhì)量較小的多肽;復(fù)配發(fā)酵組香腸多肽DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除能力顯著高于自然發(fā)酵組（P<0.05），但復(fù)配發(fā)酵組香腸多肽的羥自由基清除能力在質(zhì)量濃度較高時顯著低于自然發(fā)酵組，結(jié)合電泳結(jié)果，復(fù)配發(fā)酵組蛋白質(zhì)降解程度強(qiáng)于自然發(fā)酵組，小分子質(zhì)量肽含量增加，從而導(dǎo)致羥自由基清除能力顯著下降。綜上，本研究使用的復(fù)配發(fā)酵劑可以促進(jìn)香腸產(chǎn)生內(nèi)源性抗氧化肽，從而抑制牛肉發(fā)酵香腸氧化，為制作品質(zhì)更高、貨架期更長的牛肉發(fā)酵香腸提供了新思路。

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