鄭 慧 王思為 藍(lán) 天 樓麗君 張 峰

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除過(guò)量飲酒和其他明確肝損害因素導(dǎo)致的肝內(nèi)脂肪過(guò)度沉積，與2 型糖尿病、肥胖、代謝綜合征、心血管疾病等多種代謝異常疾病密切相關(guān)[1]。中醫(yī)認(rèn)為，NAFLD 主要以肝郁脾虛證和濕熱蘊(yùn)結(jié)證為主，屬于“肝著”“積聚”“肥氣”等范疇[2]，治療原則上主要以疏肝、健脾、理氣、化痰、活血為主[3]。枳殼，歸肝、胃、脾經(jīng)，具有理氣寬中、行滯消脹的功效，經(jīng)常被用于中醫(yī)臨床治療脂肪性肝病[4]。本課題組前期對(duì)枳殼替代藥材—衢枳殼防治代謝性疾病進(jìn)行了研究，證實(shí)衢枳殼提取物具有穩(wěn)定血糖[5]、抑制肥胖[6]、抗肝纖維化[7]、抗氧化[8]、抗炎[9]等作用，且能夠顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)積累[6]，提示衢枳殼可能具有改善NAFLD 的作用，但作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測(cè)枳殼改善NAFLD 的潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 枳殼相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過(guò)中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）檢索枳殼活性成分及其靶點(diǎn)，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的屬性值對(duì)活性成分進(jìn)行初步篩選，并根據(jù)課題組前期對(duì)枳殼成分的分析以及既往文獻(xiàn)研究證實(shí)枳殼存在的主要成分，將有關(guān)化合物納入研究中，獲得候選化合物。再通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查找到有效成分的靶點(diǎn)，通過(guò)Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）將收集到的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息校正為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。若TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)法查找到有效成分的靶點(diǎn)，則以Probability＞0為條件通過(guò)Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，將兩者匯總后刪除重復(fù)值得到該藥物靶標(biāo)。

1.2 NAFLD 相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“non-alcoholic fatty liver disease”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org）、DisGenet 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.omim.org）、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd）等疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與篩選NAFLD 的潛在靶點(diǎn)。在Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)中，Score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系密切，若靶點(diǎn)過(guò)多則設(shè)定Score 大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為非酒精性脂肪肝的潛在靶點(diǎn)；在DisGenet 數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)該數(shù)據(jù)庫(kù)推薦標(biāo)準(zhǔn)，以綜合評(píng)分分值≥0.3 為條件，篩選相關(guān)靶點(diǎn)，最后將所有疾病數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)匯總后排除重復(fù)值，從而得到NAFLD 靶點(diǎn)。

1.3 枳殼-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵成分篩選 將枳殼有效成分及靶點(diǎn)通過(guò)CytoScape3.7.2 構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)其內(nèi)置的Network Analyzer 分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)。根據(jù)degree 值大小來(lái)篩選關(guān)鍵成分，degree 值越大，說(shuō)明該成分越重要，越有可能是枳殼治療NAFLD 的主要活性成分。

1.4 枳殼有效成分-NAFLD 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心網(wǎng)絡(luò)篩選 為了明確枳殼治療NAFLD 的潛在靶標(biāo)間的相互作用，利用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org），構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型。將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”（＞0.4），其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)，然后將獲取的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖通過(guò)CytoScape 3.7.2 軟件中內(nèi)置的Network Analyzer 提取枳殼治療非酒精性脂肪肝核心網(wǎng)絡(luò)。

1.5 枳殼有效成分-NAFLD 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 運(yùn)用Metascape 平臺(tái)（http://metascape.org/gp/index.html）對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析。將枳殼治療NAFLD 的潛在靶點(diǎn)錄入Metascape 平臺(tái)進(jìn)行GO 和KEGG 分析。

1.6 活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證 通過(guò)PPI 核心網(wǎng)絡(luò)篩選獲得核心靶點(diǎn)，根據(jù)Degree 值選取排名前6 的靶點(diǎn)，然后選取對(duì)應(yīng)的活性成分，利用分子對(duì)接軟件AutoDock Vina1.5.6 驗(yàn)證預(yù)測(cè)的枳殼活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的可信度。首先通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，使用Chem3D 軟件將2D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D 結(jié)構(gòu)，然后從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載核心靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Pymlol 軟件刪除晶體結(jié)構(gòu)中的水分和配體，用蛋白受體與活性配體成分進(jìn)行AutoDock Vina1.5.6 對(duì)接，最后，比較結(jié)合自由能。

2 結(jié)果與分析

2.1 枳殼活性成分靶點(diǎn)獲取 通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查找到衢枳殼17 個(gè)活性成分，再根據(jù)OB 和DL 參數(shù)篩選后獲得5 種化合物，然后根據(jù)課題組前期對(duì)枳殼成分的研究以及相關(guān)文獻(xiàn)的進(jìn)一步檢索，其中naringin、hesperidin、L-Limonen、neohesperidin 的OB或DL 較小，但在枳殼中含量豐富，依然列入候選化合物，最終納入9 個(gè)活性成分進(jìn)行研究，見表1。通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查找到8 個(gè)有效成分的靶點(diǎn)，共計(jì)96個(gè)，其中MOL013383 成分靶點(diǎn)未在TCMSP 中找到，以Probability＞0 為條件在Swiss Target Prediction 平臺(tái)對(duì)該成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，補(bǔ)充獲得26 個(gè)靶點(diǎn)。匯總兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的成分靶點(diǎn)，排除重復(fù)值后得到衢枳殼有效成分119 個(gè)靶點(diǎn)。

表1 枳殼中經(jīng)篩選得到的候選化合物

2.2 NAFLD 相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 從Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGenet 數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲得NAFLD 靶點(diǎn)為1612 個(gè)、512 個(gè)、1059 個(gè)、4個(gè)。在Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定Score 大于中位數(shù)目標(biāo)靶點(diǎn)為NAFLD 潛在靶點(diǎn)。通過(guò)Genecards 查詢到NAFLD 靶點(diǎn)Score 最大值為100.16，最小值為0.33，中位數(shù)為4.93，故設(shè)定Score＞4.93 的條件，最終納入807 個(gè)潛在靶點(diǎn)；通過(guò)Dis－Genet 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到1059 個(gè)疾病相關(guān)基因，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)推薦標(biāo)準(zhǔn)，綜合評(píng)分分值≥0.3 的70 個(gè)靶點(diǎn)認(rèn)為與NAFLD 較為密切。合并以上所有數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)篩選后的相關(guān)靶點(diǎn)，并排除重復(fù)值，最終得到1311 個(gè)NAFLD 相關(guān)靶點(diǎn)。應(yīng)用Venny 取交集，得到枳殼有效成分-NAFLD 共同靶點(diǎn)56 個(gè)。

2.3 枳殼藥物-有效成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape3.7.2 軟件將枳殼9 種有效成分及119個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入，得到枳殼有效成分-潛在靶點(diǎn)可視網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1），其中紅色代表枳殼藥物，深紫色代表其活性成分，藍(lán)代表潛在靶點(diǎn)，共得到128 個(gè)節(jié)點(diǎn)、161 條邊。Degree 值大小通過(guò)節(jié)點(diǎn)大小反應(yīng)，節(jié)點(diǎn)越大，該成分越重要，所以β-sitosterol、naringenin、nobiletin、neohesperidin 有可能是枳殼干預(yù)NAFLD較為重要的活性成分。

圖1 枳殼-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 枳殼有效成分-NAFLD 靶點(diǎn)PPI 核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將候選基因提交至STRING 11.0 平臺(tái)，得到枳殼-NAFLD 靶點(diǎn)PPI，再將該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，利用Network Analyzer 插件篩選得到該蛋白相互作用核心網(wǎng)絡(luò)（見圖2）。圖2 中含有26 個(gè)節(jié)點(diǎn)和223 條邊。根據(jù)節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺反映度值大小，Degree 值越大，顏色越亮，表示該靶點(diǎn)越重要，與藥物和疾病的相關(guān)性越強(qiáng)。線條的粗細(xì)也反映了兩個(gè)靶點(diǎn)之前的重要性，線條越粗，說(shuō)明該連接越重要。排名較前的為AKT1、TNF、TP53、CAT、JUN、MAPK8 等靶點(diǎn)。選取degree 值排名前10 基因靶點(diǎn)，見表2。

表2 枳殼干預(yù)非酒精性脂肪性肝病核心靶點(diǎn)拓?fù)湫再|(zhì)

圖2 枳殼干預(yù)非酒精性脂肪性肝病核心PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.5 枳殼主要成分-靶點(diǎn)-疾病氣泡圖 本研究使用Metascape 平臺(tái)對(duì)56 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 分析，包括生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）3 個(gè)分支，共顯示1368 個(gè)結(jié)果富集，其中BP 為1224 個(gè)，CC 為71 個(gè)，MF 為73 個(gè)，KEGG 富集255 條通路。根據(jù)－log10（pvalue）排序，選擇前20 個(gè)通過(guò)http://www.bioinformatics.com.cn 平臺(tái)繪制氣泡圖（見圖3）。圖中P 值的顏色越紅，表示顯著性越強(qiáng)，關(guān)系越緊密，氣泡節(jié)點(diǎn)大小代表富集在上面的基因數(shù)量，氣泡越大，表示相關(guān)的基因越多，反之越小。

從圖3 可知，枳殼干預(yù)NAFLD 的靶點(diǎn)在生物過(guò)程中，主要涉及對(duì)有害物質(zhì)的反應(yīng)（response to toxic substance）、患者體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)水平的調(diào)節(jié)（response to nutrient levels）、對(duì)細(xì)胞外刺激所產(chǎn)生的反應(yīng)（response to extracellular stimulus）以及凋亡信號(hào)通路（apoptotic signaling pathway）等；從細(xì)胞組分結(jié)果可以看出，枳殼干預(yù)NAFLD 過(guò)程中主要通過(guò)細(xì)胞中脂筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）等細(xì)胞膜部位進(jìn)行；從分子功能結(jié)果看，主要與蛋白酶結(jié)合（protease binding）、蛋白質(zhì)均二聚活性（protein homodimerization activity）和氧化還原酶活性(oxidoreductase activity）關(guān)系較為密切。在KEGG 通路富集結(jié)果中，結(jié)果顯示與癌癥途徑（pathways in cancer）、NAFLD、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）等枳殼干預(yù)NAFLD的作用機(jī)制緊密相關(guān)。

圖3 枳殼干預(yù)非酒精性脂肪肝關(guān)鍵靶點(diǎn)GO、KEGG 氣泡圖

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 根據(jù)PPI 核心網(wǎng)絡(luò)分析選取排名前6的靶點(diǎn)蛋白AKT1、TNF、TP53、CAT、JUN、MAPK8，與對(duì)應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，分子對(duì)接自由能越小，則表示構(gòu)象越穩(wěn)定，兩者結(jié)合程度越高。一般認(rèn)為，當(dāng)對(duì)接結(jié)合能≤-5.0kcal/mol 時(shí)，配體與受體有較好的結(jié)合活性，因此，本研究中的關(guān)鍵靶點(diǎn)與相應(yīng)的活性成分之間具有較好的結(jié)合活性，見表3。

表3 配體與受體對(duì)接結(jié)合自由能

3 討論

基于枳殼-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，我們發(fā)現(xiàn)枳殼干預(yù)NAFLD 關(guān)鍵成分主要為β-sitosterol（β-谷甾醇）、naringenin（柚皮素）、nobiletin（川陳皮素）、Neohesperidin（新橙皮苷）。研究指出，β-谷甾醇可調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的2 型糖尿病大鼠中IRS-1/AKT 介導(dǎo)的胰島素信號(hào)分子，可減弱胰島素抵抗（IR），減輕高脂飲食引起的脂肪組織有害變化[10]。柚皮素能抑制肝細(xì)胞Nrf2 蛋白及其下游抗氧化酶表達(dá)，抑制肝脂質(zhì)過(guò)度積累的作用[11]。川陳皮素與柚皮素類似，也具有抗氧化[12]、抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和細(xì)胞凋亡的作用[13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，新橙皮苷能抑制肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，有望開發(fā)成為肝保護(hù)劑[14]。基于關(guān)鍵靶基因分析中，AKT1、TNF、TP53、CAT、JUN等靶點(diǎn)有可能在枳殼治療NAFLD 中起到重要作用。通過(guò)上述分析，提示枳殼具有多成分、多靶點(diǎn)干預(yù)NAFLD 的特點(diǎn)。

富集分析結(jié)果顯示，枳殼治療疾病的部位可能發(fā)生在細(xì)胞膜，主要從對(duì)外界有害物質(zhì)刺激所產(chǎn)生的反應(yīng)、患者體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)水平以及氧化還原過(guò)程等方面進(jìn)行干預(yù)。NAFLD 在多種細(xì)胞外刺激下，磷酸化JNK 等信號(hào)通路，引起脂質(zhì)調(diào)節(jié)異常，導(dǎo)致IR 發(fā)生，促進(jìn)NAFLD 的發(fā)展[15]。不同的飲食模式或營(yíng)養(yǎng)成分可以通過(guò)促進(jìn)肝臟TG 積累和抑制抗氧化活性直接促進(jìn)NAFLD 發(fā)生，也可以通過(guò)影響胰島素敏感性和餐后TG 代謝間接促進(jìn)NAFLD 發(fā)生[16]。我們前期研究表明，衢枳殼提取物能夠改善高脂飲食引起的小鼠肝臟脂質(zhì)積累，可作為治療NAFLD 的膳食補(bǔ)充劑[6]。KEGG 通路富集分析中NAFLD、AGE-RAGE 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路等富集顯著性較高，這些通路能減輕肝臟脂肪變性，減少炎癥反應(yīng)發(fā)生。NAFLD與脂毒性、IR 等緊密相關(guān)，IR 會(huì)加重疾病的進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)，AGEs 水平升高和AGE-RAGE 軸激活會(huì)引起氧化應(yīng)激和肝臟炎癥，與NAFLD 發(fā)病機(jī)制相關(guān)[17]。TNF-α 是促進(jìn)IR 及NAFLD 發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞因子，在NASH 患者肝臟組織表達(dá)水平增加，TNF-α 還可通過(guò)多途徑參與脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激，誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)[18]。相反，通過(guò)抑制TNFR1 可使MAP 激酶MKK7 基因及其下調(diào)基因JNK 的激活減輕，從而改善IR，延緩NAFLD 的發(fā)生[19]。

通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證得到核心靶點(diǎn)蛋白與活性成分結(jié)合較強(qiáng)，表明靶點(diǎn)與成分之間較好的結(jié)合力是枳殼發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。其中CAT 與naringenin 結(jié)合活性最強(qiáng)。CAT 作為抗氧化因子，可以限制脂肪酸的氧化反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受脂質(zhì)過(guò)氧化物的傷害。唐曉飛等[20]研究證明，柚皮素可能通過(guò)促進(jìn)SOD 和CAT生成，抑制肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，從而改善NAFLD。

綜上所述，本研究我們?cè)谇捌谧C實(shí)枳殼具有改善NAFLD 的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接驗(yàn)證法，收集枳殼治療NAFLD 潛在靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)可能的作用機(jī)制，其中主要涉及IR、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供理論指導(dǎo)。