張冠軍，顧紅躍，陳萍，李振濤，賈曉航

（湖南大學(xué)汽車車身先進(jìn)設(shè)計(jì)制造國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410082）

骨骼是一種具有層次結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料，對(duì)其力學(xué)性能的研究一直廣受關(guān)注.皮質(zhì)骨主要由礦物質(zhì)（50%-60%）、膠原蛋白（30%-40%）和水（10%-20%）組成，礦物質(zhì)比較堅(jiān)硬，而膠原蛋白比較松軟，二者的相互作用決定了骨骼的微觀力學(xué)性能［1］.皮質(zhì)骨的力學(xué)性能不僅僅取決于其組成成分，也受微觀結(jié)構(gòu)的影響［2］.皮質(zhì)骨的微觀結(jié)構(gòu)主要有環(huán)骨板、骨單位以及間質(zhì)骨，大型哺乳動(dòng)物在生長(zhǎng)發(fā)育過程還會(huì)形成層狀骨［3］.由于這幾種結(jié)構(gòu)在骨骼的分布不均勻，骨骼不同區(qū)域的力學(xué)性能也不相同.準(zhǔn)確地獲取皮質(zhì)骨的微觀力學(xué)性能不僅對(duì)理解骨骼的整體力學(xué)性能至關(guān)重要，而且對(duì)建立更加精細(xì)的有限元模型以模擬骨骼裂紋損傷也起著相當(dāng)關(guān)鍵的作用.

目前，很多學(xué)者探究了骨骼不同解剖學(xué)區(qū)域的力學(xué)性能.Bonney 等［4］采用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)探究了豬股骨不同解剖學(xué)區(qū)域的力學(xué)性能與成分之間的變化趨勢(shì)；Li 等［5］采用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)探究了牛股骨不同解剖學(xué)區(qū)域的斷裂韌性；Li 等［6］采用壓縮和拉伸試驗(yàn)方式分析了牛股骨不同解剖學(xué)區(qū)域的力學(xué)性能變化；Abdel-Wahab等［7］采用拉伸試驗(yàn)研究了骨骼不同解剖學(xué)區(qū)域以及不同方向的力學(xué)性能；Duchemin等［8］采用拉伸和壓縮試驗(yàn)探究了骨骼不同解剖區(qū)域的密度與彈性模量之間的關(guān)系；Espinoza Orías 等［9］采用超聲波測(cè)試探究了骨骼的彈性各向異性和不均勻性在不同解剖學(xué)區(qū)域的變化規(guī)律；Malo 等［10］采用聲學(xué)顯微鏡探究了骨骼彈性系數(shù)在不同解剖學(xué)區(qū)域的變化.受限于傳統(tǒng)試驗(yàn)方法對(duì)試樣尺寸、形狀等的要求，上述研究難以從微觀層面分析解剖學(xué)區(qū)域?qū)趋懒W(xué)性能的影響.

微納米壓痕測(cè)試方法能夠在微/納米尺度上開展力學(xué)測(cè)試.Rasoulian 等［11］采用參考點(diǎn)壓痕技術(shù)（RPI）探究了骨骼不同解剖學(xué)區(qū)域力學(xué)性能與成分之間的關(guān)系.Bosiakov 等［12］采用納米壓痕技術(shù)探究了骨骼不同象限的彈性性能和韌性.得益于納米壓痕技術(shù)的微觀尺度，上述研究在微觀層面上研究了骨骼不同解剖學(xué)區(qū)域的力學(xué)性能.由于骨骼試樣的生物多樣性，統(tǒng)計(jì)分析是研究骨骼解剖學(xué)區(qū)域力學(xué)差異的必要方法，但上述文獻(xiàn)在這方面存在局限性.

針對(duì)目前研究存在的不足，本文以牛股骨皮質(zhì)骨為研究對(duì)象，利用納米壓痕試驗(yàn)方法測(cè)試了骨骼不同解剖學(xué)區(qū)域的力學(xué)性能，采用統(tǒng)計(jì)方法分析了骨骼力學(xué)性能在不同解剖學(xué)區(qū)域的差異.

1 試樣制備與試驗(yàn)

1.1 壓痕試樣制備

從本地的屠宰場(chǎng)獲取一根新鮮的牛股骨，牛的年齡為18-24 個(gè)月（成年）.首先使用手術(shù)刀等工具剔除肌肉組織，進(jìn)行CT 檢查以排除病變等可能對(duì)力學(xué)性能有影響的骨骼缺陷.然后使用馬克筆在股骨中段標(biāo)記切割區(qū)域，使用手工鋸按照標(biāo)記從骨干中段獲取一個(gè)厚度為30 mm的骨環(huán)，如圖1（a）所示.再用馬克筆在骨環(huán)表面按照解剖學(xué)區(qū)域?qū)⒐黔h(huán)劃分為前、后、內(nèi)、外四個(gè)區(qū)域，使用手工鋸將骨環(huán)分割成四個(gè)扇形塊，如圖1（b）所示.隨后使用馬克筆在扇形切片的中部畫出長(zhǎng)方體試樣的橫截面（10 mm×5 mm），使用手工鋸切割得到4 個(gè)10 mm×5 mm×30 mm 的長(zhǎng)方體試樣.最后用粗糙度為320 的碳化硅砂紙（ASC，耕耘，中國）對(duì)試樣表面進(jìn)行打磨，最終尺寸為7 mm×3 mm×15 mm，如圖1（c）所示.在每個(gè)試樣的六個(gè)面標(biāo)記其方位（近心端P、遠(yuǎn)心端D）和解剖學(xué)區(qū)域（前側(cè)A、后側(cè)P、內(nèi)側(cè)M、外側(cè)L）.整個(gè)切割和打磨過程不停地噴灑濃度為0.9%的生理鹽水，以避免溫度過高對(duì)骨骼力學(xué)性能產(chǎn)生影響.

為方便試樣打磨以獲得光滑的測(cè)試面，通常將骨骼試樣鑲嵌在某種基材中.有文獻(xiàn)表明，環(huán)氧樹脂具有高黏度和快速固化的特點(diǎn)，能夠有效避免環(huán)氧樹脂滲透到骨骼的孔隙中影響骨骼的納米壓痕試驗(yàn)結(jié)果［13］.因此，本文選取環(huán)氧樹脂作為鑲嵌基材.鑲嵌時(shí)，需要將環(huán)氧樹脂和固化劑按比例混合并攪拌，待混合液清澈后澆注于放置了皮質(zhì)骨的模具中，在室溫下固化后進(jìn)行脫模以獲得環(huán)氧樹脂包裹的納米壓痕試樣，如圖2所示.

圖2 鑲嵌后的試樣Fig.2 The sample embedded in the epoxy resin

對(duì)鑲嵌好的試樣進(jìn)行打磨拋光以確保試樣的被測(cè)試面達(dá)到納米壓痕測(cè)試的粗糙度要求.分別使用粗糙度為P600、P1200、P1500、P2500、P4000 的碳化硅砂紙（ASC250A，耕耘，中國）依次對(duì)試樣表面進(jìn)行打磨，再使用3 μm、1 μm 和0.25 μm 的拋光絨布（MPF250A，耕耘，中國）配合相同規(guī)格的金剛石懸浮液（MDS，耕耘，中國）對(duì)試樣進(jìn)行初拋光，最后采用0.05 μm 的拋光絨布（MPF250A，耕耘，中國）配合相同顆粒大小的氧化鋁懸浮液（OPS，耕耘，中國）進(jìn)行最終拋光.打磨拋光過程中噴灑0.9%生理鹽水保持試樣水合.拋光完成后對(duì)試樣進(jìn)行超聲波洗滌以去除所有殘留物.清洗完的試樣利用光學(xué)顯微鏡（Pri?motech，Zeiss，Germany）觀察其表面形貌以確保試樣加載表面相對(duì)平整無劃痕，如圖3所示.

圖3 股骨皮質(zhì)骨縱向橫切面Fig.3 The longitudinal transverse section of femoral cortical bone

所有試樣制備過程中，非處理的試樣均用0.9%生理鹽水浸潤(rùn)的紗布包裹后放入試管密封，在-20 ℃環(huán)境中冷凍保存.試驗(yàn)前在室溫（25 ℃）環(huán)境下將冷凍試樣浸入0.9%的生理鹽水中解凍水合2 h.

1.2 納米壓痕試驗(yàn)

使用納米壓痕試驗(yàn)機(jī)（NHT3，Anton Paar，Swit?zerland and Austria）［14-19］對(duì)試樣進(jìn)行測(cè)試，如圖4 所示，其載荷分辨率和位移分辨率分別為0.02 μN(yùn) 和0.01 nm.由于玻氏壓頭具有壓頭端部曲率半徑小、低載荷就能引起材料的塑性變形、接觸區(qū)域易于表征、清晰度高等優(yōu)勢(shì)，在骨骼納米壓痕測(cè)試中獲得了廣泛應(yīng)用［2，3，13，19-23］，因此本文采用玻氏壓頭進(jìn)行加載.由于溫度及濕度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有較大影響，典型的測(cè)試環(huán)境溫度范圍為10～35 ℃，相對(duì)濕度范圍為20%～80%［24］，因此本文的測(cè)試環(huán)境選為室溫（25 ℃），濕度為45%～50%.

圖4 NHT3納米壓痕試驗(yàn)機(jī)Fig.4 Nanoindentation tester NHT3

測(cè)試前使用熔融的石英作為參考樣品對(duì)機(jī)器進(jìn)行校準(zhǔn)［25］.本試驗(yàn)采用載荷控制方式進(jìn)行加載，以80 mN/min 的恒定速率加載至最大載荷45 mN，然后保壓10 s以消除蠕變效應(yīng)，最后以80 mN/min 的恒定速率進(jìn)行卸載，如圖5 所示.根據(jù)骨環(huán)厚度和四個(gè)解剖學(xué)區(qū)域，確定每個(gè)試樣的中心位置.以中心為基點(diǎn)，沿骨環(huán)徑向分別向內(nèi)、向外確定6 個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)間距為1 mm；沿骨環(huán)切向分別向兩側(cè)確定3個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)間距為0.5 mm.在試驗(yàn)過程中，如遇到骨骼孔隙，壓痕點(diǎn)在骨環(huán)徑向平移0.5 mm.每個(gè)試樣測(cè)試18 個(gè)點(diǎn)，如圖6 所示.4 個(gè)試樣共計(jì)72 個(gè)壓痕點(diǎn).納米壓痕試驗(yàn)輸出加載力和壓入深度的時(shí)間歷程曲線，處理得到載荷-位移曲線.利用歸一化及再還原方法［26］獲得平均載荷-位移曲線.

圖5 納米壓痕試驗(yàn)加載曲線Fig.5 The loading curve of nanoindentation test

圖6 壓痕點(diǎn)分布示意圖Fig.6 The schematic view of indentation points distribution

1.3 試驗(yàn)結(jié)果處理

利用試驗(yàn)輸出的載荷-位移曲線，使用Oliver-Pharr 法［25，27］計(jì)算測(cè)試點(diǎn)的壓入模量及硬度.該方法假設(shè)卸載曲線初始階段為線性區(qū)域［24，25，27］，將卸載曲線在最大壓入深度處的斜率作為接觸剛度S，如式（1）所示：

式中：F是載荷，h為壓入深度，B、b和hf為根據(jù)卸載曲線采用最小二乘法擬合得到的系數(shù)，hm為最大壓入深度.

其次，通過接觸剛度S和接觸面積的投影面積Ac獲得壓入折合模量Er，如式（2）所示：

式中：β是與壓頭形狀相關(guān)的常數(shù)，玻氏壓頭為1.034［25，27，28］；Ac是接觸面積，與最初到達(dá)最大載荷時(shí)的壓入深度有關(guān)，玻氏壓頭的面積公式為A=.

壓入折合模量Er反映壓頭材料參數(shù)以及試樣材料參數(shù)的復(fù)合模量［13］，通過式（3）計(jì)算試樣的壓入模量EIT：

式中：v為骨骼的泊松比，通常取0.3［3，13，29］；vi為玻氏壓頭的泊松比，本研究中為0.07；Ei為玻氏壓頭的壓入模量，本研究中為1 140 GPa.

硬度反映材料抵抗彈塑性變形的能力，可通過最大壓入載荷和接觸面積的投影面積得到，如式（4）所示：

式中：Fm為最大壓入載荷，本文取45 mN.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本文使用SPSS 軟件（IBM Corporation，Somers，NY，USA）對(duì)壓入模量和硬度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.利用Shapiro-Wilks 方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（p＞0.05），利用Levene 檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)（p＞0.05）.對(duì)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性的參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），否則使用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以判斷解剖學(xué)區(qū)域是否顯著影響壓入模量和硬度.同時(shí)，對(duì)壓入模量和硬度進(jìn)行組間多重比較；符合方差分析條件時(shí)使用Tukey方法，符合非參數(shù)檢驗(yàn)條件時(shí)使用Bonferroni 法，以研究骨骼在不同解剖學(xué)區(qū)域上的力學(xué)差異.本研究中，顯著性水平取0.05.

2 結(jié)果

納米壓痕測(cè)試得到的各壓痕點(diǎn)的載荷-位移曲線和各解剖區(qū)域的平均載荷-位移曲線分別如圖7和圖8所示.

圖7 納米壓痕測(cè)試結(jié)果與各區(qū)域的平均載荷-深度曲線Fig.7 The average load-depth curve of nanoindentation test results and each anatomical region

圖8 不同解剖學(xué)區(qū)域的平均載荷-深度曲線對(duì)比Fig.8 Comparison of average load-depth curves at different anatomic regions

根據(jù)納米壓痕測(cè)試曲線，計(jì)算出的不同解剖學(xué)區(qū)域的壓入模量和硬度如表1 所示.分別使用Shapiro-Wilks 正態(tài)性檢驗(yàn)和Levene 方差齊性檢驗(yàn)分析各解剖學(xué)區(qū)域的壓入模量和硬度是否符合正態(tài)分布及方差齊性，結(jié)果表明不同解剖學(xué)區(qū)域的測(cè)試點(diǎn)的壓入模量不滿足正態(tài)分布（p＜0.05），硬度不滿足方差齊性（p＜0.05），所以使用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析解剖學(xué)區(qū)域?qū)喝肽Ａ亢陀捕仁欠翊嬖陲@著影響.Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示，解剖學(xué)區(qū)域?qū)喝肽Ａ浚℉=34.177，p＜0.001）和硬度（H=32.985，p＜0.001）均有顯著影響.

表1 牛股骨干皮質(zhì)骨不同解剖學(xué)區(qū)域的壓入模量和硬度Tab.1 Indentation modulus and hardness at different anatomical regions of cortical bone of bovine femoral shaft

表2 解剖學(xué)區(qū)域?qū)喝肽Ａ亢陀捕鹊腒ruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Kruskal-Wallis test results of anatomical region on indentation modulus and hardness

由于Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)不能給出不同解剖學(xué)區(qū)域間骨骼的壓入模量和硬度是否存在顯著差異，進(jìn)一步采用Bonferroni 法進(jìn)行組間多重比較，如圖9所示.對(duì)于壓入模量，外側(cè)試樣最小，內(nèi)側(cè)試樣最大；內(nèi)側(cè)和前側(cè)試樣分別比外側(cè)試樣顯著高31.6%（p＜0.001）和26.8%（p＜0.001）；內(nèi)側(cè)試樣也比后側(cè)試樣顯著高15.6%（p=0.006）.對(duì)于硬度，前側(cè)試樣最大，外側(cè)試樣最??；前側(cè)、內(nèi)側(cè)、后側(cè)試樣分別比外側(cè)試樣顯著高46.1%（p＜0.001）、30.2%（p＜0.001）和37.4%（p=0.003）.

圖9 牛股骨皮質(zhì)骨前、后、內(nèi)、外四個(gè)區(qū)域間骨骼材料特性的差異Fig.9 Differences of bone material properties among anterior,posterior,internal and external regions of bovine femoral cortical bone

3 討論

本研究利用牛股骨皮質(zhì)骨開展了納米壓痕測(cè)試，研究了不同解剖學(xué)區(qū)域?qū)ε９晒瞧べ|(zhì)骨壓入模量和硬度的影響.與文獻(xiàn)相比，本文測(cè)試得到的牛股骨皮質(zhì)骨的平均壓入模量（19.32±3.12 GPa）與Car?nelli 等［30］、Isaksson 等［31］、Akhtar 等［32］的結(jié)果基本吻合，略小于Hengsberger 等［33］的結(jié)果（如圖10 所示）.本文測(cè)試得到的牛股骨皮質(zhì)骨的平均硬度（0.57±0.12 GPa）與Akhtar 等［32］的結(jié)果基本吻合，略小于Carnelli 等［30］、Isaksson 等［31］的試驗(yàn)結(jié)果.本文試驗(yàn)結(jié)果略小的原因，可能與本研究所用試樣為濕潤(rùn)水合骨骼有關(guān).有文獻(xiàn)指出，干燥骨骼的壓入模量和硬度比水合骨骼增加20%～30%［34］，這種現(xiàn)象不僅存在于牛骨中，在人類骨骼以及其他動(dòng)物骨骼中也同樣存在［34-36］.與文獻(xiàn)對(duì)比（如表3），本試驗(yàn)得到的骨骼不同解剖學(xué)區(qū)域的壓入模量和Li 等（2013）［6］、Abdel-Wahab 等（2011）［7］的結(jié)果吻合，略小于Rasoulian 等（2013）［11］的結(jié)果，這可能與試樣物種有關(guān)，本文采用的是牛股骨，而Rasoulian采用的是人類股骨.

表3 不同文獻(xiàn)中骨骼不同解剖學(xué)區(qū)域上的彈性模量對(duì)比Tab.3 Comparison of material parameters in different anatomical region s of bones in different papers

圖10 不同文獻(xiàn)中牛股骨皮質(zhì)骨材料參數(shù)對(duì)比Fig.10 Comparison of cortical bone material parameters of bovine femur in different papers

本文研究發(fā)現(xiàn)，骨骼不同解剖學(xué)區(qū)域的壓入模量之間存在顯著差異，不同解剖學(xué)部位的壓入模量由大到小的順序?yàn)椋簝?nèi)側(cè)＞前側(cè)＞后側(cè)＞外側(cè).這種差異與骨骼各組成成分的含量密切相關(guān).牛股骨皮質(zhì)骨主要由叢狀骨、骨單位以及間質(zhì)骨構(gòu)成，其中叢狀骨的壓入模量最大，骨單位的最?。?］.Li 等（2013）［6］使用光學(xué)顯微鏡對(duì)牛股骨中間骨干橫截面進(jìn)行了光學(xué)測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛股骨皮質(zhì)骨前側(cè)和內(nèi)側(cè)中叢狀骨占多數(shù)，后側(cè)和外側(cè)中骨單位占多數(shù).因此，可以推測(cè)前側(cè)和內(nèi)側(cè)區(qū)域的壓入模量大，而后側(cè)和外側(cè)區(qū)域的壓入模量小，這與本文的研究結(jié)果（內(nèi)側(cè)顯著大于后側(cè)和外側(cè)、前側(cè)顯著大于外側(cè)）吻合.有文獻(xiàn)指出，骨骼壓入模量和硬度之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性［37］（R2=0.68，p＜0.01）［21，37］.本文的結(jié)果也表明，骨骼壓入模量和硬度之間有高度的相關(guān)性（R2=0.586，p＜0.01），例如內(nèi)側(cè)的壓入模量顯著大于外側(cè)，并且內(nèi)側(cè)的硬度也顯著大于外側(cè)；前側(cè)的壓入模量顯著大于外側(cè)，并且前側(cè)的硬度也顯著大于外側(cè).當(dāng)然，從圖7中也可以看出，本文中骨骼不同解剖學(xué)區(qū)域的壓入模量和硬度的顯著性差異并不完全一致.原因可能是壓入模量代表了骨骼的彈性能力，而硬度更多的是與骨骼的微觀破壞機(jī)制有關(guān)，比如膠原-礦物界面的移動(dòng)［38-40］，這兩者分別代表骨骼不同時(shí)期的受力情況.另外，有限的試樣數(shù)量也可能是一個(gè)影響因素.

4 結(jié)論

本文以牛股骨為試驗(yàn)對(duì)象，使用納米壓痕測(cè)試方法獲取載荷-深度曲線，使用Oliver-Pharr 法計(jì)算了皮質(zhì)骨試樣的壓入模量和硬度.非參數(shù)Kruskal-Wallis分析表明，牛股骨皮質(zhì)骨不同解剖學(xué)區(qū)域的壓入模量和硬度存在顯著差異（p＜0.001）.組間多重比較表明，前側(cè)試樣的壓入模量和硬度顯著高于外側(cè)試樣，內(nèi)側(cè)試樣的壓入模量和硬度顯著高于外側(cè)試樣，后側(cè)試樣的硬度顯著高于外側(cè)試樣，內(nèi)側(cè)試樣的壓入模量顯著高于外側(cè)試樣.在建立長(zhǎng)骨有限元模型時(shí)，有必要采用非均一的材料模擬骨骼的生物力學(xué)響應(yīng).