接智慧 周 巖 楊海燕 楊洪川 程俊蘭 許 文

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.婦產(chǎn)科；2.病理科，山東 泰安 271000

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位，發(fā)病率逐年上升，且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性健康［1］。目前，早期EC患者5年總存活率達(dá)96%［2］；對(duì)于晚期EC，即使采用手術(shù)、放化療及內(nèi)分泌治療等聯(lián)合的綜合治療方式，預(yù)后也并不理想，患者的生存率較低［3］。因此，臨床上迫切需要尋找與EC形成相關(guān)，并且有助于EC早期診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)的分子靶標(biāo)。近年來(lái)研究認(rèn)為，miR-17-92基因簇是一個(gè)與腫瘤形成有關(guān)的基因，在一系列人類腫瘤如淋巴瘤、白血病、宮頸癌和卵巢癌中均存在miR-17-92的異常表達(dá)［4］。目前，關(guān)于miR-17-92基因簇與EC關(guān)系的研究較少。在前期研究中，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇在EC Ishikawa、HEC-1A細(xì)胞系中存在異常表達(dá)［5］，因此本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，分析子宮內(nèi)膜病變組織中miR-17-92基因簇的表達(dá)，探討其異常表達(dá)情況與EC臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 資料與試劑

1.1.1 研究標(biāo)本 選取2009年1月至2015年5月于山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科就診并經(jīng)病理診斷為EC且行手術(shù)治療的患者105例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理確診為EC；（2）術(shù)前未行放化療及內(nèi)分泌治療；（3）有完整的病歷資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他腫瘤病史；（2）合并內(nèi)分泌代謝性疾病或免疫系統(tǒng)疾病；（3）合并全身感染。選取切除的EC組織，作為EC組，患者年齡26~70歲，中位年齡53.5歲，其中Ⅰ型EC 87例，Ⅱ型EC 18例，根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（international federation of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO）2009標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ、Ⅱ期患者72例，Ⅲ、Ⅳ期患者33例，F(xiàn)IGO I級(jí)29例，F(xiàn)IGO II級(jí)48例，F(xiàn)IGOⅢ級(jí)28例。另收集同期非典型增生子宮內(nèi)膜患者36例，作為非典型增生組，患者年齡32~66歲，中位年齡50.85歲；因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIA）Ⅲ行全子宮切除術(shù)的患者22例，作為正常子宮內(nèi)膜組，其中增生期內(nèi)膜組織13例，分泌期內(nèi)膜組織9例，患者年齡38~62歲，中位年齡48.4歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行內(nèi)分泌治療或放化療。標(biāo)本收集后均立即進(jìn)行液氮速凍處理并存于-80℃冰箱中備用。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組患者或家屬均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海吉瑪技術(shù)有限公司，qRT-PCR檢驗(yàn)試劑盒購(gòu)自珠海莫納生物科技公司，miR-17-92基因簇及內(nèi)參基因U6引物由上海生工生物有限公司合成，Nanodrop分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，qRT-PCR擴(kuò)增儀ABI 7500購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 qRT-PCR檢測(cè)miR-17-92基因簇表達(dá)

采取Trizol法提取組織中總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度（要求OD 260/OD 280比值在1.8~2.0），按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA產(chǎn)物置于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄校簃iR-17-92基因簇上游引物：5'-AAGGGCCGCAGCTTACACAT-3'，下 游 引 物：5'-TCCCTCACTTTGCTTCTCTTTTGAC-3'；U6上 游引物：5'-AAGGCAGCACACTCGCTTC-3'，下游引物：5'-TGGTCCGAGTGTGGTTCTGT-3'。qRT-PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)miR-17-92基因簇相對(duì)表達(dá)水平，qRT-PCR擴(kuò)增體系為20μL，反應(yīng)條件：預(yù)95℃變性5 min，95℃10 s；63℃20 s；72℃20 s；76℃20 s，共40個(gè)循環(huán)。每一樣本重復(fù)3次。采用2-??Ct法表示miR-17-92基因簇的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪

隨訪采用電話或者門診隨訪。隨訪時(shí)間為患者術(shù)后5～79個(gè)月，中位隨訪時(shí)間37個(gè)月，隨訪終點(diǎn)事件為患者死亡或者到達(dá)隨訪截止時(shí)間（2020年5月）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，兩組比較采用成組t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法分析EC患者術(shù)后生存情況，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織中miR-17-92基因簇表達(dá)情況

miR-17-92在EC組織中的相對(duì)表達(dá)量為1.489±0.038，非典型增生組織中的相對(duì)表達(dá)量為1.046±0.029，正常內(nèi)膜組織中相對(duì)表達(dá)量為0.621±0.032，miR-17-92在EC組織表達(dá)顯著高于非典型增生組織和正常內(nèi)膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.6827，P=0.016；t=5.0166，P=0.001），結(jié)果詳見(jiàn)圖1。

圖1 miR-17-92基因簇在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況

2.2 miR-17-92的表達(dá)與EC臨床病理特征的關(guān)系

分析顯示在未絕經(jīng)患者EC組織中miR-17-92的表達(dá)（1.501±0.038）高于已絕經(jīng)患者EC組織（1.486±0.029），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.257，P=0.026）；miR-17-92基因簇的表達(dá)與EC的病理類型相關(guān)，分析顯示在Ⅰ型EC組織中的表達(dá)（1.505±0.017）高于Ⅱ型EC組織（1.476±0.023），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.178，P<0.001）；miR-17-92基因簇的表達(dá)與EC肌層浸潤(rùn)深度明顯相關(guān)，分析顯示在>1/2肌層浸潤(rùn)組織中的表達(dá)（1.523±0.040）高于≤1/2肌層浸潤(rùn)組織（1.469±0.037），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-7.091，P<0.001）；而miR-17-92基因簇的表達(dá)與患者年齡、FIGO分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期無(wú)關(guān)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 miR-17-92基因簇表達(dá)與EC臨床病理特征的關(guān)系

2.3 miR-17-92的表達(dá)對(duì)EC預(yù)后的影響

以中位值為界限，將EC患者分為miR-17-92低表達(dá)組53例，中位生存時(shí)間為60個(gè)月，miR-17-92高表達(dá)組52例，中位生存時(shí)間為37個(gè)月，采用Kaplan-Meier法分析miR-17-92的表達(dá)與EC患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-17-92高表達(dá)組和低表達(dá)組的患者5年生存率分別為33.9%和49.5%，Logrank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-17-92高表達(dá)組患者的生存時(shí)間低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.074，P=0.043），見(jiàn)圖3。

圖3 miR-17-92的表達(dá)與EC患者預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

大量研究已經(jīng)證實(shí)，多種miRNA在EC中的異常表達(dá)可以影響腫瘤進(jìn)展，如miR-944在EC中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤的侵襲［6］；miR-125a-5p在EC RL95-2細(xì)胞中高表達(dá)后，能夠改變PI3K/AKT/mTOR通路活性及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制EC RL95-2細(xì)胞增殖［7］。由于一個(gè)miRNA可以靶向調(diào)控多個(gè)靶基因，一個(gè)靶基因也可以同時(shí)受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，不同miRNA通過(guò)調(diào)控多個(gè)基因形成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在腫瘤的生物學(xué)行為調(diào)控中起更加重要的作用［8-10］，miRNA基因簇具有一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)，可轉(zhuǎn)錄形成多個(gè)成熟miRNA的基因簇，同一個(gè)miRNA基因簇轉(zhuǎn)錄形成的miRNA在生物學(xué)調(diào)控中發(fā)揮協(xié)調(diào)作用［11］，因此目前關(guān)于miRNA的基因簇在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用已成為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制研究的新熱點(diǎn)。miR-17-92是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNA癌基因簇［12］，其在乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等細(xì)胞中高表達(dá)，并且參與多種類型的腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程［4］。在前期研究中，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)miR-17-92在EC Ishikawa、HEC-1A細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)［5］。本研究檢測(cè)了miR-17-92在子宮內(nèi)膜病變組織中的表達(dá)情況，顯示其在EC癌組織中的表達(dá)顯著高于非典型增生和正常內(nèi)膜組織，經(jīng)過(guò)分析癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，EC組織中miR-17的表達(dá)也顯著高于正常內(nèi)膜組織，這與本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果一致。分析EC組織中miR-17-92表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，顯示miR-17-92基因簇在深肌層浸潤(rùn)EC患者中表達(dá)高于淺肌層浸潤(rùn)者，提示其可能促進(jìn)了EC對(duì)周圍組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Chen等［13］發(fā)現(xiàn)miR-92a通過(guò)靶向磷酸酶與張力蛋白同源物蛋白（PTEN）促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。Su等［14］在宮頸癌中也發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇的相同作用。在前期研究中，本團(tuán)隊(duì)通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)Mfn2是miR-17-92的靶基因之一，研究發(fā)現(xiàn)Mfn2與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［15］，因此本研究推測(cè)miR-17-92可能通過(guò)靶向Mfn2調(diào)控EC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，在后續(xù)研究中本團(tuán)隊(duì)將對(duì)miR-17-92基因簇促進(jìn)EC腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制進(jìn)行探究。

本研究還發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇在Ⅰ型EC組織中表達(dá)顯著高于Ⅱ型EC組織，前者為雌激素依賴EC，本團(tuán)隊(duì)前期研究通過(guò)生物信息學(xué)方法富集了miR-17-92基因簇參與的信號(hào)通路和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示miR-17-92基因簇通過(guò)調(diào)控靶蛋白參與EC信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路［5］，Wang等［16］研究認(rèn)為在月經(jīng)周期、內(nèi)膜增生及內(nèi)膜癌變過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路具有維持雌激素誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和孕激素誘導(dǎo)細(xì)胞分化之間平衡的作用，這提示miR-17-92可能通過(guò)與女性雌激素的相互作用，調(diào)控Wnt信號(hào)通路在內(nèi)的多條信號(hào)通路，導(dǎo)致EC的發(fā)生，這為EC的激素治療提供了一個(gè)新的可能靶點(diǎn)。

此外，本研究對(duì)miR-17-92基因簇表達(dá)與EC患者預(yù)后關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示miR-17-92基因簇高表達(dá)的EC患者，術(shù)后5年總生存率和平均生存時(shí)間均低于miR-17-92低表達(dá)患者，提示miR-17-92基因簇高表達(dá)是EC患者預(yù)后差的危險(xiǎn)因素。通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的大量隨訪信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇成員之一的miR-17的表達(dá)水平與EC患者的生存時(shí)間也呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這與本研究的預(yù)后分析結(jié)果一致。以上結(jié)果提示miR-17-92基因簇具有作為EC患者不良預(yù)后預(yù)測(cè)的生物靶標(biāo)的潛能。

綜上所述，miR-17-92基因簇在EC組織中異常高表達(dá)，并與EC臨床病理因素和預(yù)后相關(guān)，可能參與了EC的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，有望成為EC診斷和治療的分子靶點(diǎn)。因此，深入研究miR-17-92基因簇在EC發(fā)生、發(fā)展中的詳細(xì)機(jī)制有重要的理論和實(shí)際意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突