孔令玉 魏曉玉 周行健 劉 靖 李 晶

1.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，天津 300451；

2.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北 石家莊 050017；

3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院中醫(yī)科，河北 石家莊 050011

2018年全球腫瘤生存情況調(diào)查表明食管癌（esophageal cancer，EC）的發(fā)生率及死亡率分別排在第七位和第六位，惡性腫瘤患者死亡的主要原因是淋巴轉(zhuǎn)移和血液轉(zhuǎn)移［1-2］。食管癌常見兩種類型，食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC），其中前者占絕大多數(shù)［3］。EC在東亞和非洲大陸南部地區(qū)發(fā)病率較高，中國EC發(fā)病率是全球平均水平的10倍，居于第一位，ESCC是最主要的病理組織分型［4-5］。EC的全球腫瘤生存形勢報告2010-14（CONCORD-3）顯示我國EC患者的5年生存率低于日本、韓國［6］。因為癥狀隱匿，EC發(fā)現(xiàn)時大多已處中晚期，導(dǎo)致手術(shù)治療后的預(yù)后并不樂觀［7-9］。

ESCC患者主要致死因素是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移，尋找ESCC侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)靶點等顯得尤其重要。生長抑制特異性蛋白6（Gas6）和Axl在肝細胞肝癌、肺癌等腫瘤組織和細胞高表達；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的一些轉(zhuǎn)錄因子被Gas6/Axl復(fù)合物激活［10-14］。在鱗狀細胞來源的腫瘤預(yù)后評價中常把細胞角蛋白19片段抗原21-1（CYFRA21-1），以及鱗狀細胞癌抗原（SCC-Ag）等作為監(jiān)測指標。然而，預(yù)測預(yù)后的最佳標志物仍然未知，鮮有研究著重討論ESCC腫瘤生物標志物與術(shù)后治療之間的關(guān)系［15］。有報道檢測了57例ESCC患者的病理組織，結(jié)果顯示癌胚抗原（CEA）、SCCAg以及其他特異指標對食管癌的進展過程有監(jiān)測意義［16］。

本研究檢測ESCC患者術(shù)后組織Gas6和Axl的表達水平，并分析其表達水平與ESCC最密切的三個重要標志物的相關(guān)性。以期對ESCC早期診斷、治療和疾病進展監(jiān)測提供更多靶點和療效評價依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 ESCC患者術(shù)后病理組織制備

隨機抽選河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院ESCC患者術(shù)后病理標本各20例，患者術(shù)前未接受放化療，留取術(shù)后切除的腫瘤組織（ESCC組）和癌旁正常組織（NC組）標本，選取的組織由2名高年資病理醫(yī)生確認，對ESCC組和NC組標本采取石蠟包埋切片，采用HE組織染色方法鑒定腫瘤組織和癌旁正常組織［17］，借助顯微鏡觀察且進行圖像收集。

1.2 ESCC腫瘤組織標本和癌旁正常組織標本Gas6免疫組化檢測

Gas6的表達檢測選用免疫組織化學(xué)法（IHC）［17］，首先對石蠟切片進行脫水，抗原修復(fù)，阻絕內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，然后進行一抗anti-GAS6（cell signaling technology，CST；#67202）和二抗（Servicebio，G23301）孵育觀察，使用DAPI復(fù)染細胞核進行脫水封片，在智能高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)Invitrogen EVOS FL Auto2（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）進行拍照觀察［17-18］，通過顯微鏡進行拍照和圖像收集。將細胞間質(zhì)的棕褐色及褐色染色作為評估Gas6陽性表達的指征。通過圖像分辨軟件Imagepro-Pro-Plus6.0（IPP6.0）分析每組圖片的光度值（IOD）并做統(tǒng)計處理。

1.3 ESCC腫瘤組織標本和癌旁正常組織標本Axl免疫熒光實驗

Axl表達檢測采用免疫熒光方法［19］，進行病理標本脫蠟和相關(guān)處理，進行一抗（Bioss，bs-5180R）和熒光二抗（Servicebio，GB21303）孵育，DAPI復(fù)染細胞核，封片，使用Invitrogen EVOS FL Auto2進行拍照觀察。采用IPP6.0分析每組圖片的IOD并做統(tǒng)計處理［17］。

1.4 ESCC患者腫瘤標志物檢查

20例ESCC患者分別采集晨起血液樣本，通過離心機處理，應(yīng)用羅氏檢測儀和相應(yīng)的配套試劑（瑞士羅氏公司）分別對患者的CEA、鱗癌有關(guān)抗原（SCC），以及CYFRA21-1進行檢測［17］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

收集的所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用均數(shù)±標準差描述。ESCC組與NC組對比采用獨立樣本t檢驗，Gas6、Axl表達水平與腫瘤標志物的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 ESCC組和NC組標本病理表現(xiàn)

HE染色病理組織類型確認20例EC患者的術(shù)后腫瘤標本全部為鱗狀細胞癌，癌旁對照標本經(jīng)過高年資病理醫(yī)師排除腫瘤細胞浸潤。染色后標本鏡下觀察食管腫瘤標本顯示腫瘤細胞排列呈現(xiàn)集中的趨勢，存在多處腫瘤細胞的團簇狀聚集區(qū)，認定為癌巢組織，其以外的細胞排列不規(guī)則，呈斑片條索狀，細胞核呈腫大狀態(tài)，形態(tài)表現(xiàn)極不規(guī)則。癌旁正常組織界限清晰，細胞排列同向且規(guī)律，細胞核大致呈梭形，細胞核清晰且無膨脹。見圖1。

圖1 食管癌腫瘤組織和癌旁組織HE染色，200×

2.2 ESCC組和NC組標本Gas6表達

IHC染色后鏡下觀察顯示NC組Gas6的表達量很少，而ESCC組顯像很高，IOD統(tǒng)計證實ESCC組Gas6的IOD相比NC組顯著增高（圖2A和2B，P<0.01）；另一組實驗對與ESCC診斷及預(yù)后相對密切的三個腫瘤標志物（CEA、SCC和CYFRA21-1）和腫瘤病理標本Gas6 IOD水平進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示ESCC患者的Gas6 IOD值與CEA表達水平（R2=0.6364，P<0.01）、SCC表達水平（R2=0.3552，P<0.05），以及CYFRA21-1表達水平（R2=0.6628，P<0.01）均呈正相關(guān)（圖2C）。因此實驗圖像和數(shù)據(jù)證實Gas6在ESCC腫瘤組織表達水平高，并與腫瘤診斷和預(yù)后相關(guān)。

圖2 ESCC組和NC組Gas6顯像及與腫瘤標志物關(guān)系

2.3 ESCC組和NC組標本Axl表達情況

檢測結(jié)果顯示Axl在ESCC組高表達，主要分布在細胞膜和胞漿；而在NC組表達較少。Axl的熒光圖像統(tǒng)計分析表明其在ESCC組相比NC組明顯升高（圖3A和3B，P<0.01）；對與ESCC診斷及預(yù)后相對密切的三個腫瘤標志物（CEA、SCC和CYFRA21-1）和腫瘤組織標本Axl熒光學(xué)表達量進行Pearson相關(guān)性評價，結(jié)果顯示ESCC患者的Axl IOD值與CEA表達情況（R2=0.3487，P<0.05）、SCC表達情況（R2=0.4562，P<0.01）和CYFRA21-1表達情況（R2=0.3631，P<0.01）均呈正相關(guān)（圖3C）。

圖3 ESCC腫瘤組織和癌旁組織Axl及與腫瘤標志物的相關(guān)性

3 討 論

EC仍然是嚴重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤，EC早期沒有明顯表現(xiàn)（容易誤診或延誤治療），晚期和轉(zhuǎn)移性EC患者通常會受到癌癥相關(guān)癥狀和因素的影響，從而使患者的體能狀態(tài)和生活質(zhì)量惡化［20-21］。Axl最初發(fā)現(xiàn)在血液腫瘤中升高，后又發(fā)現(xiàn)在其他實體惡性腫瘤（如肺癌）標本細胞膜和胞質(zhì)內(nèi)染色升高，且是腫瘤預(yù)后不良的影響因素［22］。Gas6和Axl能夠單獨或者聯(lián)合應(yīng)用作為原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者手術(shù)以及保守治療的可靠標志物［23-25］。Gas6與Axl（Gas6/Axl復(fù)合物）的綁定會調(diào)整腫瘤細胞的功能，比如侵襲、遷移能力，但是對于其改變腫瘤細胞功能的方式和機制尚不清楚［15-16］。此外，Axl的活化或基因沉默對肺癌的表皮生長因子受體（epithelial gr owt h f act or r eceptor，EGFR）靶向治療起到反作用，而對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移起到一定抑制作用，但是具體的作用機制尚不明確［26］。

本試驗對ESCC患者的術(shù)后組織進行檢測，結(jié)果表明ESCC腫瘤組織的Gas6和Axl活性顯著高于癌旁正常組織，這與在胃癌等組織的研究結(jié)果一致。Gas6和Axl的表達情況與ESCC患者最相關(guān)的敏感指標（CEA、SCC和CYFRA21-1）的表達水平呈現(xiàn)正相關(guān)。

本研究證明Gas6和Axl在ESCC進展中起促進作用，而且Gas6和Axl在ESCC腫瘤細胞中也是高表達的［17］。本課題組［17，27］曾用清代古方啟膈散（QGS）干預(yù)ESCC細胞，經(jīng)過基因蛋白芯片檢測，發(fā)現(xiàn)QGS對ESCC細胞Gas6有顯著抑制作用。本研究結(jié)果也為QGS抑制ESCC細胞侵襲和轉(zhuǎn)移提供了有利的證據(jù)和參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突