孫新六

泰安市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，許多細(xì)胞分子與乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)［1］，但用于診斷和治療乳腺癌效果不佳，需要尋求新的生物標(biāo)志物。L-型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（LAT1）是一種中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是運(yùn)輸中性氨基酸進(jìn)入細(xì)胞的重要載體［2］，LAT1在某些惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)［3］。氨基酸是合成蛋白質(zhì)所必需，積極增殖的癌細(xì)胞比靜態(tài)細(xì)胞需要更多的 氨 基 酸［4］。18F-氟 環(huán) 丁 烷 羧 酸（18Ffluorocyclobutane carboxylic acid，18F-FACBC）是一種合成的L-亮氨酸模擬分子，能通過LAT1被癌細(xì)胞吸收［5］。本研究旨在探討LAT1在乳腺癌中的表達(dá)及18F-FACBC與LAT1用于小動(dòng)物正電子斷層掃描儀（micro-PET）示蹤檢測(cè)乳腺癌的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

總RNA提取Trizol試劑購(gòu)于ThermoFisher公司；熒光PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司；免疫組化試劑購(gòu)于博士德生物公司。micro-PET購(gòu)于美國(guó)Sofie Biosciences公司，18F-FACBC購(gòu)于美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)

選擇惡性MCF-7和非致瘤性MCF-10A細(xì)胞株，用添加10%的胎牛血清的RPMI1640液在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入終濃度為50 U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素。

1.3 細(xì)胞總RNA提取與定量分析

采用Trizol試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞株提取總RNA。離心收集約5.0×106個(gè)培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞，按照Trizol試劑盒說明書操作提取RNA。測(cè)定總RNA純度并調(diào)節(jié)其濃度用于熒光定量PCR。引物序列：LAT1上游5'-AGGAGCCTTCCTTTCTCCTG-3'和下游5'-CTGCAAACCCTAAGGCAGAG-3'。內(nèi)參基因β-actin上游5'-AGCGGGAAATCG TGCGTG-3'和下游5'-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3'。取500 ng總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，20μL反應(yīng)體系，42℃，45 min生成cDNA。取1μl cDNA液進(jìn)行熒光定量PCR（20μL反應(yīng)體系）：95℃，10 min；35次循環(huán)：95℃，30 s；54℃，20 s；72℃，30 s。按2-△△Cq法計(jì)算MCF-7和MCF-10A細(xì)胞株中LAT1 mRNA表達(dá)水平的差異倍數(shù)。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)三管檢測(cè)3次。

1.4 Western blotting檢測(cè)

收集培養(yǎng)的兩組乳腺癌細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解液處理，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取2 mg蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳及免疫印跡分析。使用針對(duì)LAT1單克隆抗體（1∶1 000）和針對(duì)β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（1∶1 000），采用酶化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量，蛋白條帶使用Image J軟件分析。

1.5 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)MCF-7和MCF-10A細(xì)胞株的氨基酸吸收能力。約2×106個(gè)細(xì)胞暴露于5μCi18FFACBC，37℃孵育60 min。收集培養(yǎng)的細(xì)胞，離心，用冰冷的無(wú)血清HBSS培養(yǎng)液漂洗除去上清液中殘留的放射素。用γ放射素自動(dòng)計(jì)數(shù)器測(cè)量，計(jì)算每2×106個(gè)細(xì)胞攝取的放射素量。

1.6 LAT1抑制劑抑制細(xì)胞增殖

MCF-7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，加入終濃度10 mM的LAT1抑制劑BCH后，作用24 h，以MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖性。

1.7 不同分期乳腺癌LAT1表達(dá)

選取泰安市中心醫(yī)院手術(shù)摘取的乳腺癌標(biāo)本共40例（T1~T4期每期各10例），年齡34~52歲，平均（42.6±7.2）歲?；颊咄鈪⑴c本研究且簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。標(biāo)本制成石蠟組織切片并免疫組化染色，一抗LAT1單克隆抗體（1∶500稀釋）作用1 h，漂洗后加入HRP標(biāo)記的二抗，最后加入DAB顯色。染色強(qiáng)度規(guī)定為：++++，非常強(qiáng)；+++，強(qiáng)；++，中等；+，弱。計(jì)算陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的百分比（0~100%），兩者之積作為染色強(qiáng)度計(jì)分，總的計(jì)分范圍為0~400，染色強(qiáng)度≥100被認(rèn)為是陽(yáng)性。

1.8 micro-PET示蹤檢測(cè)

建立18F-FACBC-PET檢測(cè)乳腺癌動(dòng)物模型。MCF-7乳腺癌細(xì)胞注射到裸鼠乳腺脂肪組織，當(dāng)腫瘤平均體積達(dá)到500 mm3時(shí)，裸鼠經(jīng)尾靜脈注射100μL含100μCi18F-FACBC液體，作用1 h后，將小鼠麻醉，固定在micro-PET儀器上。獲得基于CT的衰減掃描數(shù)據(jù)，總共獲取30 min的影像，將得到的圖像重建、顯示和分析。荷瘤裸鼠拍攝micro-CT作為對(duì)照。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 LAT1在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析（圖1）顯示，MCF-7細(xì)胞株LAT1 mRNA高水平表達(dá)，MCF-10A細(xì)胞株LAT1 mRNA低水平表達(dá)，MCF-7細(xì)胞株LAT1 mRNA表達(dá)水平為非致瘤性MCF-10A細(xì)胞株的4.21倍，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.570，P<0.001），見表1。

表1 LAT-1基因相對(duì)表達(dá)（倍數(shù)）

圖1 LAT-1基因表達(dá)

2.2 Western blotting分析

蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)膜后免疫印跡（圖2）顯示，惡性腫瘤細(xì)胞MCF-7細(xì)胞株表達(dá)高水平的LAT1蛋白，而非致瘤MCF-10A細(xì)胞株表達(dá)水平明顯降低。MCF-7細(xì)胞株中LAT1蛋白表達(dá)水平是MCF-10A細(xì)胞株的（2.62±0.61）倍，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.450，P<0.001），見表2。

圖2 LAT-1蛋白表達(dá)

表2 LAT-1蛋白相對(duì)表達(dá)（倍數(shù)）

2.3 18F-FACBC細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

惡性乳腺癌細(xì)胞株MCF-718F-FACBC細(xì)胞攝取率為（36.2±6.4）%，非致瘤MCF-10A細(xì)胞株攝取率為（16.4±4.6）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.410，P<0.001），見表3。表明乳腺癌細(xì)胞通過LAT1對(duì)18F-FACBC的攝取率更高。

表3 18F-FACBC細(xì)胞攝取率

2.4 LAT1抑制劑作用

采用BCH選擇性抑制LAT1，MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10 mM BCH培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，MCF-7細(xì)胞存活率（62.4±10.6）%，與未加BCH對(duì)照組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.250，P<0.001），見表4。顯示LAT1參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖。

表4 BCH抑制作用

2.5 LAT1表達(dá)與乳腺癌進(jìn)展的相關(guān)性

乳腺腫瘤標(biāo)本經(jīng)石蠟組織切片免疫組化染色（圖3）后計(jì)分，T3+T4期乳腺腫瘤表達(dá)高水平LAT1（計(jì)分：256±36），而T1+T2期的乳腺腫瘤表達(dá)較低水平LAT1（計(jì)分：161±23），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.945，P<0.001），見表5。結(jié)果表明LAT1表達(dá)水平與乳腺癌的進(jìn)展相關(guān)。

表5 乳腺癌臨床分型與LAT-1表達(dá)

圖3 乳腺癌組織LAT-1免疫組化染色（×200）

2.6 micro-PET示蹤檢測(cè)

建立乳腺癌裸鼠模型，輸入18F-FACBC液，分別做micro-CT和micro-PET。18F-FACBC micro-PET能精確顯示乳腺腫瘤位置（圖4）。

圖4 荷瘤裸鼠micro-PET示蹤檢測(cè)

3 討 論

乳腺癌是女性常見腫瘤，傳統(tǒng)的乳腺癌手術(shù)治療效果欠佳，早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行針對(duì)性的靶向治療對(duì)患者至關(guān)重要。LAT1在骨肉瘤、腎癌等多種腫瘤中高表達(dá)［6］，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞攝取氨基酸［7］。LAT1已被證明在某些腫瘤組織中過表達(dá)及參與血管平滑肌細(xì)胞增殖［8］。本研究顯示，LAT1在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中高度表達(dá)。乳腺癌細(xì)胞LAT1活性增強(qiáng)，更易攝取氨基酸。T3和T4期惡性乳腺腫瘤組織LAT1免疫染色評(píng)分較高，T1和T2期腫瘤組織評(píng)分較低，表明LAT1表達(dá)水平與乳腺癌的進(jìn)展相關(guān)。此外，為了探討LAT1是否參與乳腺癌細(xì)胞的增殖，本研究采用選擇性LAT1抑制劑BCH，抑制惡性腫瘤細(xì)胞LAT1活性。結(jié)果顯示LAT1抑制劑能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，表明LAT1表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和進(jìn)展。

18F-FDG-PET被認(rèn)為是診斷腫瘤有效的臨床影像工具［9］，然而很多炎性疾病和某些良性腫瘤也呈現(xiàn)較高的18F-FDG攝?。?0］，因而限制了18F-FDG-PET的臨床應(yīng)用，所以需尋找新的替代示蹤劑。本研究顯示培養(yǎng)的乳腺腫瘤細(xì)胞對(duì)18F-FACBC具有高攝取性，乳腺癌裸鼠模型顯示乳腺腫瘤對(duì)18F-FACBC具有優(yōu)良的吸收率，因此，18F-FACBC-PET可能是一個(gè)潛在的非侵入性診斷乳腺癌的方法。18F-FACBC示蹤劑具有對(duì)癌細(xì)胞特異性強(qiáng)、半衰期長(zhǎng)、制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)［11］，是有潛力的新型PET顯像劑。micro-PET為“活體生化顯像”技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)小動(dòng)物的活體掃描和定量分析［12］，它具有空間分辨率高、體積小、造價(jià)低等優(yōu)點(diǎn)［13］，在疾病診斷、藥物研究等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景［14］。

綜上所述，本研究顯示LAT1能促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展，可能是對(duì)乳腺癌診斷和治療的一種潛在生物標(biāo)志物，18F-FACBC是micro-PET診斷乳腺癌的有效示蹤劑，18F-FACBC-PET可用于精確診斷乳腺癌。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突