苗婷，王道金，湛守青

在心臟手術期間使用的體外循環(huán)可導致白細胞激活，進而引發(fā)全身的氧化應激和炎癥反應，損傷心肌組織并引起心功能障礙[1]。保護心肌組織，及時恢復心功能具有重要臨床意義。烏司他丁是在尿液中發(fā)現(xiàn)的一種庫尼茨型人類蛋白酶抑制劑，具有抑制中性粒細胞彈性蛋白酶和抑制促炎細胞因子激活的能力[2]。研究顯示，烏司他丁可以在心臟手術后抑制促炎細胞因子水平的增加[3]，但其對心臟功能的影響和作用機制仍不清楚。肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）是細胞內激酶通路，該通路水平的升高能夠促進抗氧化和抗炎因子的分泌[4]。研究表明提高PI3K/AKT通路能夠緩解由缺血/再灌注引起的心肌組織損傷[5]。本文主要分析烏司他丁調控PI3K/AKT通路對大鼠心臟術后心臟收縮及舒張功能的影響，為臨床更好的提高心臟手術預后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料Sprague-Dawley（SD）大鼠（SPF級，雄性，8～10周，270～290 g）。HP SONOS 5500型的超聲心動圖儀（飛利浦公司，美國）。烏司他?。℉19990131，常州天普制藥）。HE染色試劑盒購自武漢華美公司（中國）。顯微鏡（蔡司，德國）。ELISA染色試劑盒（碧云天公司，中國）。酶標儀（Model 680，Bio-Rad，美國）?？贵w（Abcam公司，美國）。聚偏二氟乙烯膜（EMD 心臟手術llipore，美國）。ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）。

1.2 分組、建模和干預45只大鼠隨機分為對照組、心臟手術組、心臟手術+烏司他丁組（每組各15只）三組。根據(jù)參考文獻建立心臟手術大鼠模型[6]，將心臟手術組和心臟手術+烏司他丁組的大鼠連接心電圖，麻醉（4%水合氯醛）后連接心電圖，迅速打開胸小心撕開心包腔暴露心臟，在結扎心臟的同時進行體外循環(huán)，持續(xù)2 h。將心臟迅速放回胸腔內，簡單縫合胸腔，腹腔注射8×105U的青霉素預防感染。對照組大鼠僅暴露心臟相同時間但不結扎。心臟手術+烏司他丁組大鼠在建模后通過烏司他丁腹腔注射處理，劑量為100 kU/kg，1/d，連續(xù)7 d[7]。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 心功能檢測通過HP SONOS 5500型的超聲心動圖儀的雙通道左心室射血分數(shù)（LVEF）和左心室縮短分數(shù)（LVFS），評估左心室收縮功能。

1.3.2 HE染色大鼠吸入過量二氧化碳安樂死，心肌組織用10%甲醛溶液固定48 h，流水沖洗。不同濃度的乙醇脫水，將組織浸入蠟中，切成4～7 μm的厚度。將載玻片置于65 ℃恒溫烘箱中30 min。脫蠟切片用不同濃度乙醇浸泡5 min，自來水沖洗10 min。切片分別用伊紅溶液染色1～2 min。細胞核用蘇木精染色5 min。染色切片用純酒精脫水并在光學顯微鏡下檢查。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）大鼠安樂死前收集微靜脈血，離心（4 ℃，20 min，12 000 rpm）后使用移液槍小心吸取上層清液，加入抗體孵育2 h后加入顯色劑，10 min后終止反應。在450 nm下檢測吸光度，根據(jù)試劑盒標準曲線計算單位質量黑質組織中白細胞介素（IL）-1β、IL-6的水平。

1.3.4 Western blot檢測蛋白將心肌組織用勻漿機均勻研磨萃取總蛋白，通過BCA試劑盒測量濃度。每組取40 μg的總蛋白使用SDS-PAGE分離（10%，80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉移。在5%牛血清白蛋白（BSA）中于室溫孵育1 h。將1:500稀釋的PI3K和AKT一抗添加膜中（4 ℃，12 h）。洗滌后在加入1:2000稀釋的二抗孵育室溫下1 h。利用化學發(fā)光試劑盒顯色。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學分析統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0軟件。每個檢測進行3次平行實驗，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（SD）表示。多組間的差異采用單因素方差分析進行比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 烏司他丁對心臟手術大鼠心功能的影響三組大鼠的左心室舒縮功能比較差異顯著（P＜0.05）。心臟手術組的心臟指數(shù)[LVEF（63.84±4.37）%和LVFS（34.57±2.76 ）%]顯著低于對照組（P＜0.05），心臟手術+烏司他丁組的心臟指數(shù)[LVEF（81.49±5.21）%和LVFS（41.86±3.05）%]顯著高于心臟手術組（P＜0.05），表1。

表1 烏司他丁對心臟手術大鼠心功能的影響

2.2 烏司他丁對心臟手術大鼠左心室心肌組織損傷的影響對照組細胞核染色清晰，細胞質染色均勻，細胞排列有序。心臟手術組細胞核染色變深或變淺，心肌細胞染色變淺，形狀發(fā)生改變，排列紊亂，并且出現(xiàn)炎性浸潤。心臟手術+烏司他丁組組細胞排列異常和損傷情況均較輕（圖1）。

圖1 HE染色檢測烏司他丁對心臟手術大鼠左心室心肌組織損傷的影響（×200）

2.3 烏司他丁對心臟手術大鼠炎性因子水平的影響三組大鼠血清炎性因子比較差異顯著（P＜0.05）。心臟手術組的IL-1β（641.23±58.67 μg/L）和IL-6（1128.31±98.21 μg/L）水平顯著高于對照組（P＜0.05），心臟手術+烏司他丁組的IL-1β（297.85±33.04 μg/L）和IL-6（405.66±42.50 μg/L）水平顯著低于心臟手術組（P＜0.05），表2。

表2 烏司他丁對心臟手術大鼠炎性因子水平的影響

2.4 烏司他丁對心臟手術大鼠PI3K和AKT蛋白表達水平的影響三組大鼠左心室心肌組織中PI3K和AKT蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。心臟手術組的PI3K和AKT蛋白水平顯著低于對照組（P＜0.05），心臟手術+烏司他丁組的PI3K和AKT蛋白水平顯著高于心臟手術組（P＜0.05），（圖2，表3）。

圖2 Western blot檢測烏司他丁對心臟手術大鼠PI3K和AKT蛋白表達水平的影響

表3 烏司他丁對心臟手術大鼠PI3K和AKT蛋白相對表達水平的影響

3 討論

心臟相關手術需要在體外循環(huán)下進行，而體外循環(huán)接收后機體炎性反應升高，可能會引起心功能障礙、急性肺損傷和多器官衰竭等并發(fā)癥，并導致術后恢復時間、遲拔管時間和重癥監(jiān)護病房住院時間的延長[8]。而有效的保護心肌組織及時恢復心臟灌注功能則具有重要的臨床意義。

烏司他丁是一種尿胰蛋白酶抑制劑，可抑制胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和中性粒細胞彈性蛋白酶等多種炎性蛋白酶[9]。目前，烏司他丁在中、日、韓等國廣泛用于炎癥性疾病患者的治療、術后器官保護、休克、和胰腺炎的治療[10]。近年來研究顯示烏司他丁具有提高心臟手術患者預后的作用，一項臨床研究顯示，烏司他丁能夠顯著抑制心臟手術術后的輸血和紅細胞輸注，促進患者的恢復[11]。為分析烏司他丁對心臟手術后炎性反應和和心功能的影響，本研究根據(jù)參考文獻利用暴露心臟+體外循環(huán)的方式模擬心臟手術。結果顯示心臟手術組大鼠血清炎性因子顯著升高，心肌組織出現(xiàn)炎性損傷，且心臟的射血功能和舒縮功能降低。而烏司他丁干預后，炎性細胞因子顯著降低，心肌組織損傷緩解，心功能顯著恢復。陳玉紅等[12]的研究結果表明烏司他丁能夠緩解由膿毒癥引起的心功能損傷。也有研究顯示烏司他丁能夠通過激活抗氧化通路保護心肌梗死大鼠的心功能[13]。結合文獻報道和本次研究結果，說明烏司他丁能夠緩解心臟手術大鼠的心肌損傷，并保護心臟的舒縮功能。

為進一步分析烏司他丁保護心臟手術大鼠心功能的機制，本研究檢測了烏司他丁對心肌組織中PI3K/AKT通路的影響。如前所述，心臟手術后誘發(fā)的氧化應激和炎性反應是導致心肌損傷的重要機制，而PI3K/AKT通路不但具有抗氧化功能，還需有抗炎功能[14]。Yang等[15]的研究結果表明提高PI3K/AKT通路的水平能夠提高缺血性心力衰竭的心功能。本次研究結果顯示，心臟手術模型大鼠心肌組織中的PI3K和AKT蛋白表達水平顯著降低，而烏司他丁干預后，PI3K和AKT蛋白表達水平顯著升高。王宇霆等[16]的研究結果顯示烏司他丁可通過激活PI3K/AKT通路緩解氧化應激引起的心肌細胞損傷。也有研究顯示烏司他丁可通過促進PI3K/AKT通路緩解異丙腎上腺素引起的慢性心臟衰竭，保護心臟功能[17]。結合文獻，本次研究結果提示烏司他丁的保護心臟手術模型大鼠心功能的作用可能與促進PI3K/AKT通路有關。

本此研究也有一定的局限性，本研究僅為定性研究，關于烏司他丁的使用劑量和安全性仍需要進一步的臨床研究。此外，關于烏司他丁調控PI3K/AKT通路的分子機制，以及通過PI3K/AKT通路保護心功能的機制仍需要體內或者體外的驗證實驗證實。

綜上所述，烏司他丁可提高心臟手術大鼠的心功能，并促進PI3K/AKT通路。本研究結果提示烏司他丁可有效的保護心臟手術后的心臟功能，可能成為改善心臟手術預后的新方法。