金燁 張能華 陳興英 畢微 馮云杰

鮑曼不動(dòng)桿菌（AB）是一種非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌，廣泛分布于水、土壤、人體皮膚、口腔黏膜、呼吸道和泌尿道等。近年來，醫(yī)院住院患者病原菌檢出中AB有所增加。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥性也不斷增強(qiáng)，出現(xiàn)越來越多的MDR-AB甚至PDR-AB。大蒜素是大蒜中含硫化合物的獨(dú)特成分，具有殺菌消炎、抗?jié)?、降血壓的作用。還可以降低血脂、血糖，調(diào)節(jié)體脂和碳水化合物代謝紊亂，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理作用。本文探討大蒜素聯(lián)合頭孢派酮/舒巴坦對(duì)AB的抑制作用，并觀察其抗菌效果。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與藥物 分離自本院ICU住院患者的AB 60株，其中包括30株頭孢哌酮/舒巴坦敏感AB和30株頭孢哌酮/舒巴坦耐藥AB，排除同一患者同一部位的重復(fù)分離菌株。敏感AB的頭孢哌酮/舒巴坦MIC范圍為1～4 mg/L，耐藥AB的頭孢哌酮/舒巴坦MIC范圍為64～512 mg/L。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC35218，購于杭州泰茂生物科技有限公司?？咕幬铮捍笏馑兀ㄅ?hào)：12A022，北京索萊寶科技有限公司）、頭孢哌酮/舒巴坦（批號(hào)：X86428，輝瑞制藥有限公司）。

1.2 主要儀器及試劑 恒溫培養(yǎng)箱由上海博迅公司生產(chǎn)；比濁儀、VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀和哥倫比亞血瓊脂均由法國生物梅里埃公司生產(chǎn)；96孔微量板，批號(hào)：050318D010503A，無錫耐思生物科技有限公司；吐溫-20，批號(hào)：626N041，北京索萊寶科技有限公司；1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC），批號(hào)：20181121，杭州微生物試劑有限公司；MH肉湯，批號(hào)：720A031，北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法 （1）頭孢哌酮/舒巴坦溶液及大蒜素溶液的制備：頭孢哌酮/舒巴坦溶液的制備：使用0.9%氯化納液為溶劑制備256 g/L的頭孢哌酮/舒巴坦溶液。用MH肉湯將其稀釋至不同濃度梯度。以20%的吐溫-20為溶劑制備10 g/L的大蒜素溶液。（2）菌懸液的制備：挑取4～5個(gè)純培養(yǎng)菌落，接種肉湯增菌，6 h后取菌液通過比濁儀調(diào)節(jié)至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋s為1.5×108CFU/mL），然后再用MH肉湯稀釋至1.5×106CFU/mL。（3）TTC溶液制備：將1%氯化三苯四氮唑溶液用蒸餾水稀釋至0.25%備用。（4）微量肉湯稀釋法采用棋盤法設(shè)計(jì)，設(shè)置11個(gè)稀釋濃度，將大蒜素和頭孢哌酮/舒巴坦溶液分別依次倍比稀釋。每藥各取50 μL加入96孔平板中，形成不同濃度抗菌藥物組合，頭孢哌酮/舒巴坦溶液濃度分別為128 g/L、64 g/L、32 g/L、16 g/L、8 g/L、4 g/L、2 g/L、1 g/L、0.5 g/L、0.25 g/L、0.125 g/L；大蒜素溶液濃度為：5 g/L、2.5 g/L、1.25 g/L、0.625 g/L、0.3125 g/L、0.15625 g/L、0.078125 g/L。加入已調(diào)至約1.5×106CFU/mL的各實(shí)驗(yàn)菌懸液10 μL，35℃培養(yǎng)18～24 h。每孔加入0.25%TTC 5μL，培養(yǎng)2 h后肉眼觀察培養(yǎng)物，紅色即為有菌生長，在設(shè)立陰性溶劑對(duì)照的前提下，判讀MIC［1］。每個(gè)菌株重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。記錄最低抑菌濃度（MIC）值，計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（FIC指數(shù)），F(xiàn)IC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用。判讀標(biāo)準(zhǔn)：FICI≤0.5時(shí)，兩藥為協(xié)同作用；0.5＜FICI≤1時(shí)，兩藥為相加作用；1＜FICI≤2時(shí)，兩藥為無關(guān)作用；FICI＞2時(shí)，兩藥為拮抗作用［2］。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦對(duì)AB作用效果 見表 1、2。

表1 頭孢哌酮/舒巴坦耐藥AB MIC值變化（）

表1 頭孢哌酮/舒巴坦耐藥AB MIC值變化（）

項(xiàng)目 大蒜素MIC（mg/L） 頭孢哌酮/舒巴坦MIC（mg/L）單用 489.58±212.16 161.33±102.67聯(lián)用 215.82±179.36 66.29±49.46 t值 5.397 4.568 P 值 ＜0.001 ＜0.001

表2 頭孢哌酮/舒巴坦敏感AB MIC值變化表（）

表2 頭孢哌酮/舒巴坦敏感AB MIC值變化表（）

項(xiàng)目 大蒜素MIC（mg/L） 頭孢哌酮/舒巴坦MIC（mg/L）單用 562.50±127.14 2.10±0.96聯(lián)用 461.26±206.57 1.72±0.81 t值 2.286 1.675 P值 0.027 0.099

2.2 大蒜素與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用對(duì)AB的FIC指數(shù)分布情況 當(dāng)單獨(dú)使用兩種藥物時(shí)，其MIC值范圍分別為大蒜素312.5～1,250 mg/L，頭孢哌酮/舒巴坦1～512 mg/L。聯(lián)合使用后，頭孢哌酮/舒巴坦敏感組FIC≤0.5占0%；0.5＜FIC≤1占23.3%；1＜FIC≤2占76.7%；FIC＞2占0%。頭孢哌酮/舒巴坦耐藥組FIC≤0.5占26.7%；0.5＜FIC≤1占60.0%；1＜FIC≤2占13.3%；FIC＞2占0%，見圖1。

3 討論

AB致病力較弱，通常侵襲免疫功能受損的宿主如ICU患者，可引起肺炎、血流感染、傷口感染、腦膜炎、肝膿腫、心內(nèi)膜炎、尿路感染等［3］，成為住院患者的嚴(yán)重危險(xiǎn)因素［4-5］。CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)網(wǎng)顯示2017年、2018年AB始終占據(jù)全國不發(fā)酵糖革蘭性桿菌檢出排名首位［6-7］，且耐藥趨勢日漸嚴(yán)重。隨著人類對(duì)其研究的深入發(fā)現(xiàn)AB的耐藥機(jī)制繁復(fù)多樣，一株細(xì)菌常集結(jié)多種耐藥機(jī)制。其中對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥機(jī)制就有多種，包括產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、外膜蛋白改變、外排泵、青霉素結(jié)合蛋白位點(diǎn)改變等［8］，β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是其耐藥的主要因素。舒巴坦作為一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，可有效抑制多重耐藥AB產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，直接作用于細(xì)菌的青霉素結(jié)合蛋白，殺滅AB的效果非常顯著［9］。文獻(xiàn)報(bào)道在碳青霉烯類耐藥AB感染的臨床治療中，舒巴坦相比多黏菌素表現(xiàn)出更好的治療效果［10］。另考慮到舒巴坦類藥物的低經(jīng)濟(jì)成本，故在MDR AB感染中優(yōu)選舒巴坦類制劑。然而，CHINET數(shù)據(jù)顯示2013～2017年AB對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為36.4%、37.7%、38.1%、43.0%、43.5%，呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢［11-13］，對(duì)臨床治療提出嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

大蒜素是存在于大蒜中的一種含硫化合物復(fù)合體。是以大蒜鱗莖為原料提取的化合物，其在蒜酶作用下通過蒜氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。大蒜提取物具有廣譜的抗菌活性，對(duì)常見的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌具有良好的抗菌活性，包括金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌［14-18］。其對(duì)皮膚癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和鼻咽癌具有良好的預(yù)防及治療作用。此外，大蒜素對(duì)心血管疾病也有不錯(cuò)的療效，可以有效降低血脂、血壓、抗心律失常、抑制糖尿病性心肌病的心肌細(xì)胞凋亡［19］。

本資料結(jié)果顯示，大蒜素與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合使用后，對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦敏感的AB抗菌作用大部分表現(xiàn)為無關(guān)效應(yīng)，大蒜素對(duì)提高頭孢哌酮/舒巴坦AB的抑菌活性無明顯作用。耐藥組中大蒜素和頭孢哌酮/舒巴坦的MIC均有明顯下降，主要表現(xiàn)為協(xié)同或相加效應(yīng)，大蒜素可提高頭孢哌酮/舒巴坦對(duì)AB的抑菌活性。大蒜素能降低頭孢哌酮/舒巴坦與對(duì)其耐藥的部分AB的MIC值，可能機(jī)制是增加舒巴坦作為酶抑制劑的活性，從而起到殺滅細(xì)菌的治療效果，為臨床治療提供一個(gè)新的聯(lián)合用藥方案。本次實(shí)驗(yàn)頭孢哌酮/舒巴坦耐藥組對(duì)AB大部分表現(xiàn)為協(xié)同作用和相加作用與國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［20］結(jié)果相似。有報(bào)道稱TEM作為被研究最多的β-內(nèi)酰胺酶之一，抑制其單個(gè)TEM-1分子活性需要約10,000個(gè)舒巴坦分子［21］。大蒜素與頭孢哌酮/舒巴坦在體內(nèi)聯(lián)合作用有效是否因大蒜素可以有效抑制TEM基因的表達(dá)，使頭孢哌酮/舒巴坦發(fā)揮更好的殺菌活性，將是今后進(jìn)一步研究的方向。