宋玉鳳 ,朱俊向 ,于丁一 ,張小軍 ,馬劍鋒

(1.浙江海洋大學 食品與藥學學院,舟山 316021;2.浙江省海洋水產研究所 水產品加工與質量安全研究室,舟山 316021;3.青島農業(yè)大學 食品科學與工程學院,青島 266109;4.重慶艾世特檢測技術服務有限公司,重慶 400000)

膽固醇是一種環(huán)戊烷多氫菲類衍生物,不溶于水,易溶于甲醇、乙醚等溶劑,廣泛存在于動物及人體內。人體內膽固醇大部分來自于自身合成,少部分需要膳食補充,食用過多膽固醇含量高的食物易引發(fā)動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等心腦血管疾病,嚴重威脅人類的健康[1-2]。通常認為,膽固醇的主要膳食來源為蛋類和肉類制品,卻往往忽視了水產品,而水產品中的蟹、貝及蝦類中的膽固醇含量普遍偏高。因此,測定和評估水產品中的膽固醇含量,對指導普通消費者和高膽固醇血癥患者的科學飲食十分重要。

在1977年人民衛(wèi)生出版社出版的第二版《食品成分表》中,首次添加了食品中的膽固醇數據,該書經過多次修訂,又添加了其他各種食品的膽固醇數據,但這些數據均為比色法測定結果,準確度不高。目前關于食品中膽固醇的檢測方法一般為高效液相色譜法(HPLC)[3]、超高效液相色譜法(UHPLC)[4]和氣相色譜法(GC)[5]等。由于水產品中膽固醇常以膽固醇酯和游離膽固醇的形式存在[6],這些方法一般先將樣品進行皂化處理,使樣品中的膽固醇酯水解為膽固醇,然后再測定膽固醇含量。與比色法相比,這些方法減少了樣品中膽固醇的損失,但其操作比較復雜、有機試劑用量較大[7-8]。鑒于此,需要提供一種操作簡便、綠色環(huán)保、提取高效的前處理方法。

液液萃取法具有簡單、快速的特點,但其消耗的有機溶劑量較多。針對此問題,有學者設計了雙水相體系(ATPS),該方法的提取劑主要為水,操作條件溫和,提高了試驗人員的操作安全性[9]。雙水相膠束體系(ATPMS)為添加了堿性離子液體的ATPS,由于其中含有表面活性劑,當溫度超過濁點時,體系將發(fā)生相分離,以此來完成目標物的萃取[10]。該方法最初用于蛋白質的分離,隨后逐漸用于病毒、脫氧核糖核酸(DNA)、細菌素、抗生素和卟啉等的分離[11],然而,該方法用于膽固醇分離的報道較少,尚無水產品方面的應用研究。

基于文獻[12],本工作以具有催化酯交換[13]、糖苷鍵水解和酯鍵水解反應[14]性能的堿性離子液體氫氧化1-丁基-3-甲基咪唑鹽([C4mim]OH)催化水解水產品中膽固醇酯,用由0.5%(質量分數,下同)1-丁基-3-甲基咪唑乙酸鹽([C4mim]Ac)和5.0%(質量分數,下同)Triton X-114組成的ATPMS[介質為檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)]提取膽固醇,得到的膽固醇含量用UHPLC 測定。該方法操作簡便、綠色環(huán)保、提取高效,可為完善我國水產品脂質營養(yǎng)調查和評價以及推進脂類化合物分析技術的發(fā)展提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY 型超高效液相色譜儀;Avanti JXN-30型冷凍離心機;MS-3 型圓周振蕩器;HH-S11-6型水浴鍋;SK25IO HP型超聲波清洗器。

膽固醇標準儲備溶液:1 000 mg·L-1,稱取膽固醇標準品0.05 g,用無水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中,于4 ℃冰箱保存。

膽固醇標準溶液系列:取適量膽固醇標準儲備溶液,用無水乙醇逐級稀釋配制成質量濃度分別為5,10,25,50,200 mg·L-1的膽固醇標準溶液系列。

ATPMS:內 含0.5% [C4mim]Ac 和5.0%Triton X-114,介質為檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)。

[C4mim]OH、1-丁基-3-甲基咪唑咪唑鹽([C4mim]Im)、氯化1-丁基-3-甲基咪唑鹽([C4mim]Cl)、氯化1-己基-3-甲基咪唑鹽([C6mim]Cl)、氯化1-辛基-3-甲基咪唑鹽([C8mim]Cl)、1-丁基-3-甲基咪唑磷酸二氫鹽([C4mim]H2PO4)、[C4mim]Ac、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽([C4mim]HSO4)等堿性離子液體的純度均不小于99%;表面活性劑Triton X-114純度不小于98%;甲醇、乙腈均為色譜純;膽固醇標準品的純度不小于98%;其他試劑均為分析純;試驗用水為高純水。

1.2 儀器工作條件

ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),柱溫38 ℃;流動相為甲醇,流量2.0 mL·min-1;進樣量5μL;分析波長205 nm;分析時間10 min。

1.3 試驗方法

將水產品(草魚、大黃魚、鯽魚、梭子蟹、青蟹、青蝦、南美白對蝦)肌肉組織攪碎成肉糜狀樣品,稱取0.10 g,加入0.36 mol·m L-1[C4mim]OH 離子液體1 mL,于90 ℃加熱30 min,冷卻后以5 000 r·min-1轉速離心5 min。取全部上清液,加入3 mL ATPMS,加熱至濁點,保持3 min,取出下層相,用甲醇定容至5 mL,渦旋30 s,超聲5 min。分取1 mL過0.22μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 催化水解條件的選擇

以大黃魚為待測對象,以[C4mim]OH、[C4mim]Im、[C4mim]Cl、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl、[C4mim]H2PO4、[C4mim]Ac、[C4mim]HSO4催化水解組作為試驗組,參考GB 5009.128-2016《食品安全國家標準 食品中膽固醇的測定》,以0.36 mol·L-1氫氧化鉀溶液催化水解組作為對照組,以去離子水催化水解組作為空白組。按照試驗方法分析,用方差分析軟件對試驗組、對照組和空白組結果進行顯著性差異分析,結果見圖1。其中,柱狀圖上字母標識一致的代表結果差異不顯著(P＞0.05),不一致的代表結果差異顯著(P≤0.05)。

圖1 不同催化劑的催化效果Fig.1 Catalytic effect of different catalysts

由圖1可知:經[C4mim]OH 和[C4mim]Ac催化后得到的膽固醇含量顯著高于其他離子液體和空白組的(P≤0.05),其中,[C4mim]OH 催化得到的膽固醇含量高于對照組的,[C4mim]Ac組略低于對照組的。因此,試驗選擇[C4mim]OH 離子液體來催化水解樣品中的膽固醇酯。

試驗還考察了催化水解時間分別為10,20,30,40 min,催化水解溫度分別為70,90 ℃時大黃魚中膽固醇含量的變化,結果見圖2。

圖2 不同水解溫度和水解時間下[C4 mim]OH對膽固醇酯的催化效果Fig.2 Catalytic effect of[C4 mim]OH to cholesterol ester at different hydrolysis temperatures and different hydrolysis times

由圖2可知,隨著催化水解時間的延長,所得膽固醇的含量逐漸上升,30 min后趨于穩(wěn)定,且90 ℃下的催化效果優(yōu)于70 ℃下的,因此試驗選擇在90 ℃下加熱30 min 來催化水解樣品中的膽固醇酯。

2.2 ATPMS組成的選擇

按照試驗方法比較了膽固醇在分別由[C4mim]OH、[C4mim ]Im、[C4mim ]Cl、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl,[C4mim]H2PO4、[C4mim]Ac、[C4mim]HSO4組成的ATPMS中的分配系數(K),以濁點分相后下層相中膽固醇的質量濃度和上層相的質量濃度的比值計算K,并用方差分析軟件進行結果的顯著性差異分析,結果見圖3。其中,柱狀圖上字母標識一致的代表結果差異不顯著(P＞0.05),不一致的代表結果差異顯著(P≤0.05)。

由圖3 可知,膽固醇在由[C4mim]Im 或[C4mim]Ac組成的ATPMS中的K顯著高于其他離子液體的(P≤0.05),說明這兩種離子液體對膽固醇的提取效果較好,因此試驗選擇以[C4mim]Im或[C4mim]Ac配制ATPMS溶液。

圖3 膽固醇在不同離子液體組成的ATPMS中的KFig.3 Values of K of cholesterol in ATPMS with different ionic liquids

在ATPMS中,非離子表面活性劑形成的膠束和水之間存在能量效應的競爭,在熵效應的作用下,體系的微觀無序度增加,宏觀狀態(tài)趨于有序和穩(wěn)定,并在濁點下產生相的分離[15]。ATPMS 的濁點會隨著非離子表面活性劑Triton X-114 以及咪唑類離子液體質量分數的變化而變化,因此試驗考察了[C4mim]Ac 或[C4mim]Im 的質量分數分別為0.1%,0.5%,1.0%,Triton X-114 的質量分數分別為3.0%,5.0%,7.0%,9.0%時對膽固醇在ATPMS中K的影響,以確定最優(yōu)的相分離條件,結果見圖4。

圖4 Triton X-114和離子液體的質量分數對膽固醇在ATPMS中K 的影響Fig.4 Effect of mass fraction of Triton X-114 and ionic liquid on value of K of cholesterol in ATPMS

由圖4 可知:當Triton X-114 的質量分數為5.0%時,膽固醇在ATPMS中的K較高,其他質量分數下的均較低;當[C4mim]Ac或[C4mim]Im 的質量分數均為0.5%時的K較高,0.1%時的次之,1.0%時的較低。因此,試驗選擇5.0% Triton X-114 和0.5%[C4mim]Ac 或[C4mim]Im 來配制ATPMS。

2.3 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件分析膽固醇標準溶液系列,以膽固醇的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線,所得膽固醇的線性回歸方程為y＝2.216×104x+1.773×103,線性范圍為5～200 mg·L-1,相關系數為0.999 9。

分別以3 倍、10 倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),并換算為以質量分數計,結果分別為7.5,25μg·g-1。

2.4 精密度和回收試驗

按照試驗方法對草魚、大黃魚、鯽魚、梭子蟹、青蟹、青蝦、南美白對蝦樣品進行加標回收試驗,每種樣品平行測定5次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表1。其中:試驗組1和試驗組2均以[C4mim]OH 為催化劑,分別以[C4mim]Im 和[C4mim]Ac組成的ATPMS為提取劑;對照組參考GB 5009.128-2016以氫氧化鉀為催化劑,以甲醇為提取劑。

由 表1可知:試驗組2的回收率(84.1%～89.9%)略大于試驗組1的(80.0%～83.9%),和對照組的(84.8%～90.0%)接近;試驗組1、試驗組2和對照組測定值的RSD 基本一致,均小于3.0%。綜上,本方法的準確度和精密度較好,可選擇結果和對照組更接近的試驗組2提取水產品中的膽固醇。

表1 精密度和回收試驗結果(n＝5)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

本工作以堿性離子液體[C4min]OH 催化水解膽固醇酯,ATPMS提取膽固醇,UHPLC 測定樣品中膽固醇的含量,該方法簡便、環(huán)保、準確可靠,可用于水產品中膽固醇含量的測定。