宋居易 ,陳嘯天 ,劉舒芹 ,班 睿 ,向章敏

(1.貴州民族大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,貴陽 551000;2.廣東省科學(xué)院測試分析研究所 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510070;3.貴州師范學(xué)院 化學(xué)與材料學(xué)院,貴陽 550018)

砂仁是一種具有較高藥用價(jià)值的中藥材,屬于豆蔻屬類植物。砂仁中既有揮發(fā)性有效成分又有非揮發(fā)性有效成分[1-4],其中的揮發(fā)性成分有降低血糖[5]、預(yù)防阿爾茲海默病[6]、抑菌[7]等作用,因此檢測其中的重要活性化學(xué)成分(如萜類、黃酮類化合物)及其含量,對于了解其功效價(jià)值具有重要意義。當(dāng)前,一般先采用同時(shí)蒸餾法提取砂仁中的揮發(fā)性成分,再用一維氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法或紫外分光光度法等對其含量進(jìn)行測定[8]。然而,這種提取方法存在耗時(shí)、能量和試劑消耗大、高溫提取影響成分組成等問題。頂空-固相微萃取法(HSSPME)是一種集采樣、濃縮、萃取、進(jìn)樣為一體的原位前處理方法,具有快速、高效、低能耗、低消耗、高可靠性等優(yōu)勢[9-10]。然而,HS-SPME由于吸附能力較強(qiáng),往往需要結(jié)合更高通量的色譜來進(jìn)行后續(xù)含量的測定。全二維氣相色譜法(GC×GC)是通過正交連接的方式將具有不同分離機(jī)制的兩個(gè)色譜柱連接起來的一種方法,具有分離度更高、峰容量更大的特點(diǎn),可與HS-SPME聯(lián)合使用。因此,本工作分別使用HS-SPME和同時(shí)蒸餾法提取3個(gè)產(chǎn)地共6批砂仁樣品中的揮發(fā)性成分,并用全二維氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(GC×GC-QTOFMS)測定其含量,用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對兩種提取方法進(jìn)行比較,以期為不同產(chǎn)地砂仁鑒別及活性成分分析提供方法參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B-7250型氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀;SM1800型全二維氣相調(diào)制器,配PLS2型多功能三位一體自動(dòng)進(jìn)樣器;Canvas全二維數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);BSA224S型分析天平;HAD2513型同時(shí)蒸餾萃取裝置;自制編織芳環(huán)聚合物＠聚多巴胺復(fù)合材料(KAP＠PDA)纖維頭[11]。

C8～C20的13 種正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于99.9%;二氯甲烷、氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。砂仁樣品采自廣東省、云南省和廣西省,每地采集兩批樣品,其中第一批樣品編號GZCZL、YN、GX,第二批樣品編號JHK、YN-PRT、GX-YL。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 GC×GC條件

柱1為DB-1MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm),柱2為DB-17色譜柱(1.0 m×0.18 mm,0.18 μm)。升溫程序:初始溫度為50 ℃,保持1 min;以6 ℃·min-1升溫至250 ℃,保持2 min。恒流模式,流量為1.0 mL·min-1。進(jìn)樣口溫度250 ℃;不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣時(shí)間3 min。

參照固態(tài)熱調(diào)制器原理設(shè)置全二維調(diào)制器參數(shù)[12]。熱區(qū)1(進(jìn)口端)升溫程序:初始溫度為80 ℃,保持1.00 min;以6 ℃·min-1升溫至280 ℃,保持2.00 min。冷區(qū)升溫程序:初始溫度為9 ℃;以-50 ℃·min-1降溫至-51 ℃,保持16.47 min;以20 ℃·min-1升溫至9 ℃,保持15.56 min。熱區(qū)2(進(jìn)口端)升溫程序:初始溫度為170 ℃,保 持1.00 min;以6 ℃·min-1升溫至320 ℃,保持10.33 min。調(diào)制周期5 s。

1.2.2 QTOFMS條 件

電子轟擊離子(EI)源;電離能量70 e V;離子源溫度200 ℃,四極桿溫度150 ℃,傳輸線溫度280 ℃;掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)45～400;采集速率m/z12 500 s-1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 同時(shí)蒸餾法-GC×GC-QTOFMS

將干燥的砂仁樣品用四分法縮分至5 g,然后用粉碎機(jī)粉碎后過孔徑為0.42 mm(60 目)的篩網(wǎng)。取30.00 g樣品于同時(shí)蒸餾裝置一端的1 L燒瓶中,再加入50 g氯化鈉和300 mL 水,用200 ℃電熱套加熱。在另一端加入60 mL二氯甲烷并于60 ℃水浴加熱,蒸餾3 h。反應(yīng)結(jié)束后,取二氯甲烷相,用無水硫酸鈉干燥除水,氮吹去除二氯甲烷,得到的淡黃色液體即為砂仁揮發(fā)油,分取10μL 砂仁揮發(fā)油于1 mL色譜瓶中,按照1.2節(jié)條件進(jìn)樣分析。

1.3.2 HS-SPME-GC×GC-QTOFMS

取砂仁樣品5 mg置于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中,用瓶蓋密封。設(shè)置頂空固相微萃取的條件為平衡溫度50 ℃,平衡時(shí)間5 min,用KAP＠PDA 纖維頭萃取50 min后按照1.2節(jié)條件進(jìn)樣分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

按照與C8～C20的13 種正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間以及NIST17 數(shù)據(jù)庫的匹配程度進(jìn)行定性分析。參考文獻(xiàn)[13-14],以面積歸一化法定量。基于統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SIMCA 14.1和SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HS-SPME條件的選擇

試驗(yàn)考察了平衡溫度分別為30,40,50,60,70 ℃,平衡時(shí)間分別為5,10,15,20,25,30 min,萃取時(shí)間分別為10,20,30,40,50,60 min時(shí)對揮發(fā)性成分總峰面積的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1可知:砂仁中揮發(fā)性成分的總峰面積隨平衡溫度的升高先增加后減小,當(dāng)平衡溫度為50,60 ℃時(shí),總峰面積較大;在平衡時(shí)間5～30 min內(nèi),揮發(fā)性成分總峰面積的變化幅度較小;在萃取時(shí)間10～60 min 內(nèi),揮發(fā)性成分總峰面積呈階梯式上升,當(dāng)萃取時(shí)間為50,60 min時(shí),揮發(fā)性成分總峰面積較大。綜合考慮,試驗(yàn)選擇平衡溫度50 ℃、平衡時(shí)間5 min、萃取時(shí)間50 min。

圖1 平衡溫度、平衡時(shí)間和萃取時(shí)間對砂仁中揮發(fā)性成分總峰面積的影響Fig.1 Effect of equilibrium temperature,equilibrium time and extraction time on total peak area of volatile components in Amomum villosum

2.2 定性與定量分析結(jié)果

按照試驗(yàn)方法分析6個(gè)砂仁樣品中的揮發(fā)性成分,并基于文獻(xiàn)[11]進(jìn)行定性分析:①利用NIST17數(shù)據(jù)庫對檢出成分進(jìn)行峰匹配,正匹配度和反匹配度均需大于75%;②保留指數(shù)是對10 mg·L-1的C8～C20的正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,響應(yīng)值(保留指數(shù))與文獻(xiàn)方法的誤差應(yīng)在30以內(nèi);③分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)實(shí)測值與理論值的相對誤差的絕對值不超過0.000 2%。滿足上述3 個(gè)條件下,HSSPME和同時(shí)蒸餾法檢出的成分分別為162 種和178種。采用面積歸一化法進(jìn)行半定量分析,發(fā)現(xiàn)GX、GX-YL、GZCZL、JHK、YN 和YN-PRT 檢出成分的峰面積占總峰面積的比例分別為94.21%,95.69%,95.02%,94.42%,95.45%,95.92%(HSSPME)和92.74%,93.39%,90.45%,92.97%,92.06%,91.18%(同時(shí)蒸餾法),經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn),共同檢出的成分有115種。

對兩種方法檢出的揮發(fā)性成分進(jìn)行分類和匯總,各類化合物峰面積占總峰面積的比例見表1。

表1 各類化合物峰面積占總峰面積的比例Tab.1 Proportions of peak area of various types of compounds in total peak area %

由表1可知,烯烴類化合物在揮發(fā)性成分中占比最高。通過HS-SPME獲得的烯烴類化合物和萜類化合物占比明顯高于同時(shí)蒸餾法的,酯類化合物占比略高于同時(shí)蒸餾法的,醇類、酮類和芳香烴類化合物占比低于同時(shí)蒸餾法的,其中酮類化合物是由于揮發(fā)性較低所致;HS-SPME 在1個(gè)樣品中檢出了吡嗪類化合物,而同時(shí)蒸餾法在6個(gè)樣品中均檢出了烷烴類化合物。

HS-SPME 檢出的162 種揮發(fā)性成分的定性、定量分析結(jié)果見表2,其中帶“*”標(biāo)記的為兩種方法共同檢出的揮發(fā)性成分,以面積歸一化法計(jì)算相對含量?！?”為當(dāng)前使用的NIST17庫沒有提供理論值。

由表2可知,相對含量大于1.00%的揮發(fā)性成分為香橙烯、倍半香檜烯、乙酸香葉酯、γ-依蘭油烯、律草烯、β-倍半萜烯、檀香萜烯、反式石竹烯、反式-α-香檸檬烯、大根香葉烯D、芳樟醇、β-卡丁烯、L-樟腦、α-蒎烯、γ-異丁烯二烯、β-欖香烯、β-紅沒藥烯、二環(huán)大根香葉烯、樟腦、消旋龍腦、乙酸龍腦酯、乙酸左冰片酯等,這與文獻(xiàn)[15-18]報(bào)道結(jié)果一致。

表2 HS-SPME檢出的砂仁中揮發(fā)性成分的定性及定量結(jié)果Tab.2 Qualitative and quantitative results of volatile components in Amomum villosum by HS-SPME

表2 (續(xù))

表2 (續(xù))

表2 (續(xù))

表2 (續(xù))

2.3 主成分-判別分析結(jié)果

基于文獻(xiàn)[19],以兩種方法的檢出結(jié)果分別建立主成分-判別分析法(PCA-DA)模型。PCA-DA模型參數(shù)樣本數(shù)(N)、模型X 軸方向的累積解釋率(R2X)以及模型累計(jì)預(yù)測率(Q2)分別為18,0.762,0.582(HS-SPME)和18,0.926,0.839(同 時(shí) 蒸 餾法),其中R2X 大于0.4,Q2大于0.5,說明以兩種方法所建的模型性能均較好,同時(shí)蒸餾法的略優(yōu)于HS-SPME的。

采用SIMCA 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪制PCA-DA 得分圖,以對兩種提取方法的鑒別能力進(jìn)行評價(jià),結(jié)果見圖2。

圖2 兩種提取方法所得兩批樣品的PCA-DA 得分圖Fig.2 PCA-DA score graphs of two batches of samples obtained by two extraction methods

由圖2可知:HS-SPME 所得第一批樣品和第二批樣品有明確的區(qū)分,且每批樣品均能按照產(chǎn)地進(jìn)行聚類;同時(shí)蒸餾法所得第一批樣品和第二批樣品沒有明確的區(qū)分,且采集于廣東省的第二批樣品不能很好地聚集在一起,說明HS-SPME 對產(chǎn)地和批次的鑒別能力高于同時(shí)蒸餾法的。

2.4 正交偏最小二乘法-判別分析結(jié)果

鑒于此,基于文獻(xiàn)[20-23],以正交偏最小二乘法-判別分析法(OPLS-DA)提取造成兩種方法差異的主要成分(共22種),建立具有代表性的變量組模型[圖3(a)],并進(jìn)行200次交互驗(yàn)證[圖3(b)],以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠襁^擬合。提取模型的變量投影重要度(VIP)值,尋找對組間差異貢獻(xiàn)較大(VIP值大于1)的成分,所得結(jié)果見圖3。其中1*,2*和3*為同時(shí)蒸餾法檢出成分,分別對應(yīng)1-甲基-4-(6-甲基庚-5-烯-2-亞基)環(huán)己-1-烯、3,7,11,11-四甲基雙環(huán)[8.1.0]十一碳二烯和石竹稀。

圖3 兩種提取方法所得OPLS-DA 結(jié)果Fig.3 OPLS-DA results obtained by two extraction methods

由圖3可知:模型參數(shù)R2X、模型Y 軸方向的累積解釋率(R2Y)、Q2均符合模型良好擬合的條件[圖3(a)];R2的模擬值均大于Q2的模擬值,且Q2的回歸線的截距為-0.768,小于0.05,說明模型不存在過擬合現(xiàn)象[圖3(b)];VIP值大于1.0的成分有22個(gè),可將其作為組間差異性成分[圖3(c)]。

在篩選出的22種差異性成分中,HS-SPME 檢出的有22種,同時(shí)蒸餾法檢出的有20種(甲酸龍腦酯和馬芐烯酮除外),基于22種差異性成分峰面積的最小值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和最大值,利用Excel和Visio軟件繪制兩種方法的熱圖,以反映差異性成分在兩種提取方法中的響應(yīng)情況,結(jié)果見圖4,其中灰度越大,表示響應(yīng)越大。

由圖4 可 知:HS-SPME對消旋龍腦、樟腦、δ-欖香烯、γ-依蘭油烯、香橙烯等成分的響應(yīng)優(yōu)于同時(shí)蒸餾法的,說明HS-SPME 對這些物質(zhì)的分析效果優(yōu)于同時(shí)蒸餾法的,同理也可以得出同時(shí)蒸餾法分析效果較優(yōu)的物質(zhì)為α-松油醇、異龍腦、α-卡丁醇等。

圖4 兩種提取方法檢出的22種差異性成分的熱圖Fig.4 Heat maps of 22 differential components detected by two extraction methods

由表3可知,α-松油醇、α-沒藥醇、α-香檸檬醇的統(tǒng)計(jì)量F值大于1,且檢驗(yàn)水平P值小于0.01,說明同時(shí)蒸餾法和HS-SPME對這3種成分的分析有極顯著性影響,其余物質(zhì)影響相對較小。

表3 22種差異性成分的方差分析結(jié)果Tab.3 Results of variance analysis of 22 differential components

基于GC×GC-QTOFMS,采用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對分別用HS-SPME和同時(shí)蒸法前處理后的砂仁中揮發(fā)性成分進(jìn)行比較。結(jié)果表明:同時(shí)蒸餾法檢出的揮發(fā)性成分較多,酮類、醇類和芳香烴類化合物占比較高,烷烴類化合物為特異性檢出成分;HSSPME 檢出的萜類、烯烴類和酯類化合物占比較同時(shí)蒸餾法的高,產(chǎn)地鑒別及產(chǎn)品聚類能力較強(qiáng);可篩選出22種差異性成分區(qū)分兩種方法,其中α-松油醇、α-沒藥醇、α-香檸檬醇為極顯著差異成分。在提取砂仁中揮發(fā)性成分時(shí),可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用選擇提取方法,推薦采用更加環(huán)保、高效、萜類化合物提取量更高的HS-SPME。