曹英杰，顧夏夢(mèng)，陳曉嵐*，郭乃鳳，陳 旭，劉 靜

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，南通 226001)

免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)腎病是全球最常見的原發(fā)性腎小球疾病，也是我國進(jìn)入終末期腎病的主要原發(fā)病[1]。目前IgA 腎病的具體發(fā)病機(jī)制及影響病情發(fā)展的因素仍未完全明確。外泌體系活細(xì)胞分泌的可攜帶細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)因子的雙層脂質(zhì)膜囊泡，直徑30～100 nm，可由不同類型的細(xì)胞脫落釋放，存在于多種體液中，傳遞信號(hào)并能夠放大信號(hào)產(chǎn)生的效應(yīng)。近年來外泌體在自身免疫性疾病中的作用一直是研究熱點(diǎn)[2-4]。IgA 腎病患者體內(nèi)存在免疫異常，NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)是構(gòu)成機(jī)體防御反應(yīng)的重要因素，能調(diào)控固有免疫系統(tǒng)，在應(yīng)激和炎性的病理?xiàng)l件下，誘導(dǎo)體內(nèi)Caspase-1 依賴的細(xì)胞焦亡[5-6]。經(jīng)典的IgA腎病發(fā)病機(jī)制認(rèn)為糖基化異常的IgA1 及其復(fù)合物的沉積系關(guān)鍵，而活化免疫細(xì)胞分泌的外泌體是否對(duì)腎臟有直接的影響尚未有具體研究，本研究探討血清外泌體中NLRP3 的含量與IgA 腎病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為其發(fā)病機(jī)制及臨床治療靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018 年1 月—2019 年12 月于南通大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)腎活檢及臨床指標(biāo)確診為原發(fā)性IgA 腎病患者60 例；另選擇因腎良性腫瘤行手術(shù)切除患者15 例為對(duì)照組。排除合并其他慢性疾病，包括風(fēng)濕病、慢性肝病、糖尿病和腫瘤患者。所有患者入組時(shí)均未經(jīng)過系統(tǒng)治療，未使用過免疫抑制劑等藥物。本研究方案由南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：2018-L036)，所有受試對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 臨床資料及標(biāo)本采集 采集患者空腹上臂靜脈血15 mL，-80 ℃保存，使用時(shí)于37 ℃下快速溶解。統(tǒng)計(jì)24 h 尿量，取100 mL 送檢。血、尿標(biāo)本送檢驗(yàn)科檢測(cè)血清肌酐及24 h 尿蛋白定量，內(nèi)生肌酐清除率按Cockcroft-Gault 公式計(jì)算：內(nèi)生肌酐清除率=(140-年齡)×體質(zhì)量(kg)/72×血清肌酐(mg/dL)，女性按計(jì)算結(jié)果×0.85。IgA 腎病腎組織標(biāo)本系由超聲引導(dǎo)下行經(jīng)皮腎穿刺活檢術(shù)取得。對(duì)照組系離腫瘤部位較遠(yuǎn)的正常腎組織，所有腎組織于術(shù)后部分置于10%甲醛中固定，部分置于液氮中，并保存于-80 ℃冰箱。

1.3 血清外泌體的提取與鑒定 清晨抽取空腹入組患者上臂靜脈血，待血液完全凝固后，3 000 r/min離心5～10 min，吸出上清，分裝備用。按Hieff TM Quick exosome isolation kit(上海翊圣生物科技有限公司，41202ES08)外泌體提取試劑盒操作，外泌體經(jīng)固定液、鋨酸固定，不同濃度乙醇脫水并在環(huán)氧樹脂浸透過夜、包埋后切片、鉛鈾染色，至透射電鏡下觀察攝片。同時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志。

1.4 血清外泌體中NLRP3 及CD19 含量的測(cè)定提取血清外泌體，PBS 洗滌離心后，向沉淀中加入4 ℃預(yù)冷RIPA 裂解液，混勻后置于冰上30 min，4 ℃13 000 r/min 離心15 min，收集上清。按NLRP3 ELISA Kit(江萊生物JL18318-48T)，人CD19 ELISA Kit(上海信裕生物科技有限公司，XY-CD19-Hu)試劑盒步驟操作，檢測(cè)外泌體內(nèi)NLRP3 及CD19 的含量。

1.5 免疫組織化學(xué)法 腎組織于4%甲醛中固定，予脫水、透明、浸蠟包埋，經(jīng)切片、烘干、脫蠟、抗原修復(fù)處理后，于3%H2O2室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗3 min×3 次；加一抗免抗人NLRP3 抗體(Abcam 公司ab263899，1:30 稀釋)、兔抗人CD19 抗體(Abcam 公司，ab227688，1:100 稀釋) 4 ℃過夜；PBS 沖洗，再滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(批號(hào)：A0208，上海碧云天生物工程有限公司，1:200 稀釋)，室溫孵育30 min；PBS 洗滌，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、封片，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析處理軟件測(cè)定積分光密度值，計(jì)算平均值。

1.6 腎臟病理積分標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)IgA 腎病Katafuchi積分標(biāo)準(zhǔn)[7]，腎小球病變積分為0～12 分，包括系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生程度(0～4 分)；節(jié)段性腎小球病變，如新月體形成、球囊壁粘連、節(jié)段性硬化和節(jié)段性毛細(xì)血管壁纖維素樣壞死(0～4 分)；腎小球球性硬化(0～4 分)，積分評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為：(1)無，0 分；(2)<10%，1分；(3)10%～25%，2 分；(4)>25%～50%，3 分；(5)>50%，4 分。將60 例IgA 腎病患者根據(jù)該積分，分為4 組：0～3 分(Ⅰ組)17 例，4～6 分(Ⅱ組)19 例，7～9 分(Ⅲ組)15 例，10～12 分(Ⅳ組)9 例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較行t 檢驗(yàn)，多組間比較行方差分析，雙變量之間的相關(guān)分析行Pearson相關(guān)分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的基線資料比較 各組患者年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨病理積分的增加，患者尿蛋白定量逐漸升高，內(nèi)生肌酐清除率逐漸降低，兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組患者臨床指標(biāo)比較(n,)

表1 各組患者臨床指標(biāo)比較(n,)

注：與對(duì)照組相比，△P＜0.05；與Ⅰ組相比，△P＜0.05；與Ⅱ組相比，#P＜0.05；與Ⅲ組相比，@P＜0.05。

2.2 血清外泌體中NLRP3 的含量與腎臟疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性 IgA 腎病組血清外泌體中NLRP3 的含量較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，且隨病理積分的增加而上升，呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.72,P<0.05)(表2，圖1A)；而且血清外泌體中NLRP3 的含量與24 h 蛋白尿呈正相關(guān)(r=0.58,P＜0.05)(圖1B)，與內(nèi)生肌酐清除率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.64,P＜0.05)(圖1C)；此外，外泌體中CD19的含量與對(duì)照組相比明顯上升，且隨病理積分的增加而上升(表2)。

表2 血清外泌體中NLRP3 及CD19 的含量()

表2 血清外泌體中NLRP3 及CD19 的含量()

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與Ⅰ組相比，△P＜0.05；與Ⅱ組相比，#P＜0.05；與Ⅲ組相比，@P＜0.05。

圖1 血清外泌體及腎臟組織中NLRP3 的表達(dá)與各指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系

2.3 腎臟組織中NLRP3 的相對(duì)含量與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系 IgA 腎病組腎臟組織中NLRP3 的含量較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，且隨病理積分的增加而上升(表3，圖2，見封二)，與病理積分呈正相關(guān)(r=0.73,P＜0.05)(圖1D)。腎臟組織中CD19 的含量與對(duì)照組相比亦明顯升高，且隨病理積分的增加而上升(P＜0.05)(表3，圖2)。IgA 腎病患者血清外泌體中NLRP3 的含量與腎臟組織中NLRP3 表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.61,P＜0.05)(圖1E)。

圖2 腎臟組織中NLRP3 及CD19 的表達(dá)(400×)

表3 腎臟組織中NLRP3 及CD19 的表達(dá)相對(duì)量()

表3 腎臟組織中NLRP3 及CD19 的表達(dá)相對(duì)量()

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與Ⅰ組相比，△P＜0.05；與Ⅱ組相比，#P＜0.05；與Ⅲ組相比，@P＜0.05。

3 討論

IgA 腎病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及免疫反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)，仍未完全明確，除有創(chuàng)檢查腎活檢外，尚缺乏有效評(píng)估病情的方法，IgA 腎病多數(shù)呈進(jìn)展性，確診20 年內(nèi)有20%～40%進(jìn)入終末期[8-10]。外泌體來源于體內(nèi)活細(xì)胞釋放，攜帶多種脂質(zhì)、核酸及蛋白質(zhì)等信息，在細(xì)胞與細(xì)胞之間進(jìn)行物質(zhì)和信息的傳遞[11-12]。研究[13]表明IgA 腎病的發(fā)病機(jī)制中存在B 細(xì)胞活化及體內(nèi)炎癥介質(zhì)的反應(yīng)，而NLRP3 炎癥小體作為一種多蛋白復(fù)合體，可誘導(dǎo)細(xì)胞活化、炎癥介質(zhì)的釋放，引起一系列炎癥反應(yīng)，參與機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)的調(diào)控。NLRP3 分子質(zhì)量大約為700 ku，能感受胞質(zhì)內(nèi)多種微生物應(yīng)激代謝產(chǎn)物，多種信號(hào)通路如NFκB 等均參與其激活[14-15]。目前炎癥小體在自身免疫性疾病中的作用成為研究的熱點(diǎn)，眾多疾病均涉及NLRP3 炎癥小體的活化[16]。

近年來，多項(xiàng)研究[17-20]表明NLRP3 參與腎臟病的發(fā)病。C.ZHANG 等[17]通過體外實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞可表達(dá)NLRP3 和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白。J.LICHTNEKERT 等[18]在抗基底膜腎炎大鼠模型腎組織中發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1β 前體、Caspase-1、NLRP3 mRNA 水平上調(diào)，且與腎臟病理損傷程度密切相關(guān)。A.VILAYSANE 等[19]通過腎臟組織病理檢查發(fā)現(xiàn)正常腎臟組織中NLRP3 有少量表達(dá)，而在腎臟疾病中NLRP3 的表達(dá)顯著上升，且其表達(dá)量與患者血清肌酐水平呈正相關(guān)。NLRP3 炎癥小體在如骨髓瘤腎病、造影劑腎病、橫紋肌溶解癥、尿酸鹽腎病等晶體類物質(zhì)相關(guān)腎病中亦有表達(dá)增加，但NLRP3 炎癥小體在腎實(shí)質(zhì)非免疫細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)途徑仍然不清楚[20]。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IgA 腎病患者血清外泌體內(nèi)NLRP3 炎癥小體的含量明顯升高，且隨患者尿蛋白定量增加而上升，呈正相關(guān)關(guān)系，與內(nèi)生肌酐清除率呈負(fù)相關(guān)，且與腎臟病理損害的程度呈正相關(guān)，提示血清外泌體內(nèi)NLRP3 炎癥小體的含量與IgA 腎病的病情相關(guān)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)外泌體中CD19 的表達(dá)亦增加，CD19 系B 細(xì)胞表面特有標(biāo)志，推斷NLRP3 含量增加的外泌體有可能來源于B細(xì)胞。通過對(duì)IgA 腎病患者腎組織內(nèi)NLRP3 的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IgA 腎病患者腎組織內(nèi)NLRP3的表達(dá)明顯升高，主要集中于系膜區(qū)，且與腎臟病理損害程度呈正相關(guān)，CD19 在系膜區(qū)的表達(dá)也有增強(qiáng)。患者血清外泌體內(nèi)NLRP3 含量與腎臟組織內(nèi)NLRP3 含量有一致性。由此推斷血清外泌體內(nèi)NLRP3 參與IgA 腎病的發(fā)生及發(fā)展。

課題組前期研究[21]顯示IgA 腎病患者中B 淋巴細(xì)胞刺激因子的水平明顯升高，導(dǎo)致B 細(xì)胞的異?；罨?，同時(shí)發(fā)現(xiàn)B 細(xì)胞可向腎臟遷移，推測(cè)B 細(xì)胞外泌體亦可通過血液循環(huán)作用于腎臟。本研究顯示腎組織內(nèi)NLRP3 及CD19 的表達(dá)主要沉積于系膜區(qū)，推測(cè)B 細(xì)胞外泌體可能與系膜細(xì)胞作用參與IgA 腎病發(fā)生，此為下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，IgA 腎病患者血清外泌體和腎臟組織中NLRP3 表達(dá)均升高，血清外泌體及腎臟組織中NLRP3 表達(dá)趨勢(shì)具有一致性，且與IgA 腎病的嚴(yán)重程度相關(guān)，由此，血清外泌體NLRP3 表達(dá)可作為IgA腎病病情變化的檢測(cè)指標(biāo)，也為臨床IgA 腎病治療提供新的靶點(diǎn)。