周 楠，黃一烝，胡亞娥，蔣永瑩，劉愛芬，楊 萍*

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，南通 226001)

自從O.WARBURG 在1956 年提出著名的“無氧糖酵解理論”，認(rèn)為無氧糖酵解在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，無氧代謝也被認(rèn)為是腫瘤的標(biāo)志物之一[1-2]。即使在氧存在的情況下，腫瘤細(xì)胞也主要依賴分解糖原產(chǎn)生能量，導(dǎo)致高濃度乳酸的產(chǎn)生和堆積[3-4]。一方面，無氧糖酵解能產(chǎn)生能量，維持腫瘤細(xì)胞的生長和其他活動(dòng)；另一方面，糖酵解產(chǎn)生的乳酸能使腫瘤微環(huán)境的pH 值降低，創(chuàng)造一個(gè)能促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的酸性環(huán)境[5-7]。在多種腫瘤如淋巴瘤[8]、乳腺癌[9]、胰腺癌[10]和前列腺癌[11]中，組織和細(xì)胞中乳酸濃度和腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。因此，乳酸含量和酸性微環(huán)境已被公認(rèn)為是腫瘤診斷和抗腫瘤治療的標(biāo)志物[12]。

乳酸通過促進(jìn)細(xì)胞干性相關(guān)基因或轉(zhuǎn)錄因子如SP1、MAZ、MEIS1 等高表達(dá)或過表達(dá)使細(xì)胞重編程。但是，乳酸促進(jìn)淋巴瘤發(fā)生的機(jī)制還不明確。二代測序技術(shù)和基因表達(dá)譜分析表明，淋巴瘤的起始和發(fā)展與原癌基因的多位點(diǎn)突變導(dǎo)致腫瘤發(fā)生相關(guān)信號通路的激活密切相關(guān)[1,13-14]。此外，高濃度的乳酸和酸性腫瘤微環(huán)境也常見于淋巴瘤患者，對病情惡化起了一定的推動(dòng)作用。乳酸可能是通過促進(jìn)淋巴瘤發(fā)生過程中關(guān)鍵原癌基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，而這些原癌基因有哪些迄今尚未見報(bào)道。

本課題組采用無致瘤性的B 淋巴母細(xì)胞HMY2-CIR 作為細(xì)胞模型來研究乳酸是否能促進(jìn)淋巴母細(xì)胞的致瘤性及其機(jī)制，以期為乳酸引起細(xì)胞干性和致瘤性的原因提供新視角。

1 材料與方法

1.1 材料 乳酸購于Sigma(上海)公司。HMY2-CIR細(xì)胞株購于ATCC(Manassas,VA)。RNase-free DNaseⅠ購于Qiagen(上海)。TaqTMDNA 聚合酶購買于TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd。RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒購于南京諾維贊公司。Methocult H4230 methylcellulose 甲基纖維素購于Stem Cell Technologies。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物由上海生工生物技術(shù)有限公司訂購。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HMY2-CIR 細(xì)胞株的培養(yǎng)液是在DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，且調(diào)節(jié)成不同pH 值。培養(yǎng)條件為5%CO2，37 ℃，每3 d 換1 次培養(yǎng)基，持續(xù)8 周。

1.3 低pH 培養(yǎng)基制備 20 mmol/L 乳酸溶解于DMEM 中，用pH 計(jì)測試溶液的pH 值，且在培養(yǎng)基中加入鹽酸將溶液的pH 值調(diào)至5.6 和6.0。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測 HMY2-CIR 細(xì)胞分別用pH=7.4、6.0 和5.6 的培養(yǎng)基培養(yǎng)8 周，每3 d 換1 次培養(yǎng)基，然后利用甩片機(jī)將細(xì)胞黏附到玻片上，用瑞姬氏染液進(jìn)行染色。

1.5 細(xì)胞增殖測定 采用Alamar Blue 法進(jìn)行檢測：將相同數(shù)量的HMY2-CIR 細(xì)胞加入96 孔培養(yǎng)板中，并在每個(gè)孔中加上述不同pH 值的培養(yǎng)基，200 μL/孔，用二甲基亞砜作為對照，培養(yǎng)3 d 后，在每個(gè)孔中加入10 μL 的Alamar Blue 染液。并在37 ℃，5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用Spectra-Max M5 multi-detection reader 讀取560～590 nm 的吸光度值。

1.6 集落生成實(shí)驗(yàn) HMY2-CIR 細(xì)胞在不同pH 值的培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 周后，用新鮮培養(yǎng)基洗2 遍，重懸計(jì)數(shù)。取1×103個(gè)活細(xì)胞與Methocult H4230 methylcellulose(甲基纖維素)混合后置于30 mm 培養(yǎng)皿中，于37 ℃和5%CO2條件下培養(yǎng)。14 d 后，對克隆的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)(細(xì)胞＞50 個(gè)為克隆)，并用體視顯微鏡(SZX16,OLYMPUS)進(jìn)行拍照。

1.7 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR) 從用乳酸處理過的HMY2-CIR 細(xì)胞中提取總RNA。然后用RevertAid First Strand cDNA Synthesis 試劑盒和oligo(dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，20 μL 反應(yīng)體系中含有5 μg 總RNA，還需加入RNase-free DNase Ⅰ。25 μL 的RTPCR 反應(yīng)體系中含有1 μL cDNA 和1 μL TaKaRa Taq DNA 聚合酶。反應(yīng)條件為94 ℃4 min，94 ℃30 s，58～68 ℃30 s，25～35 個(gè)循環(huán)，72 ℃1 min。RT-PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，所用的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以表示，采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳酸和酸性環(huán)境對細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增殖的影響 在20 mmol/L 乳酸、培養(yǎng)基pH=6.0 或5.6 的條件下，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，明顯的特征是細(xì)胞核變大、細(xì)胞質(zhì)變少，顯示出細(xì)胞去分化的形態(tài)特征(圖1A)。Alamar Blue 法的結(jié)果證實(shí)，含有20 mmol/L乳酸的培養(yǎng)基能顯著促進(jìn)HMY2-CIR 細(xì)胞增殖(圖1B)。因此，乳酸和酸性環(huán)境能誘導(dǎo)B 淋巴母細(xì)胞HMY2-CIR 細(xì)胞去分化，并能促進(jìn)其增殖。

2.2 乳酸和酸性環(huán)境使無致瘤性的HMY2-CIR 獲得致瘤性 集落生成實(shí)驗(yàn)14 d 后，在正常的培養(yǎng)基(pH=7.4)中培養(yǎng)的HMY2-CIR 細(xì)胞沒有集落生成的能力，不能形成集落；相反，在經(jīng)過20 mmol/L 乳酸和酸性培養(yǎng)基(pH=6.0)培養(yǎng)后，HMY2-CIR 細(xì)胞的集落生成能力提高了150 倍(圖2A)，且將培養(yǎng)基pH調(diào)至5.6 后，集落生成的數(shù)量達(dá)(200±37)個(gè)(圖2B)，提示乳酸和酸性環(huán)境均可增加無致瘤性的淋巴母細(xì)胞的腫瘤形成能力。

圖2 乳酸和酸性環(huán)境增強(qiáng)人B 淋巴母細(xì)胞HMY2-CIR 的致瘤性

2.3 乳酸和酸性環(huán)境誘導(dǎo)細(xì)胞干性和致瘤性的機(jī)制研究 對乳酸和酸性環(huán)境誘導(dǎo)后，許多原癌基因的表達(dá)被上調(diào)。干細(xì)胞標(biāo)志基因ALDH1A1 被上調(diào)了9倍之多，EpCAM 的表達(dá)量上調(diào)了3.7 倍，Nestin、Oct4和KLF4 分別上調(diào)了3.2、2.8 和3.1 倍；然而，CD34、C-KIT、MYC 和Nanog 等基因表達(dá)無明顯上調(diào)(圖3)。這些證據(jù)表明，乳酸和酸性環(huán)境選擇性地使B 淋巴母細(xì)胞中部分原癌基因的表達(dá)上調(diào)，從而增加細(xì)胞的干性和致瘤性。

圖3 乳酸和酸性環(huán)境促進(jìn)HMY2-CIR 細(xì)胞中多個(gè)與細(xì)胞致瘤性相關(guān)基因過表達(dá)

3 討論

乳酸在細(xì)胞的許多活動(dòng)中起著重要作用，包括能量調(diào)節(jié)、免疫耐受、細(xì)胞記憶、損傷修復(fù)等[15]。另外，乳酸可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，高濃度乳酸和酸性環(huán)境與淋巴瘤的惡化和預(yù)后差密切相關(guān)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，乳酸能促進(jìn)許多與腫瘤干性和發(fā)生相關(guān)的原癌基因過表達(dá)，從而使無致瘤性的B 淋巴母細(xì)胞去分化，增強(qiáng)其致瘤的能力。乳酸能夠引起基因重編程，從而促進(jìn)細(xì)胞的干性，為乳酸誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生提供新的依據(jù)。

ALDH1A1 被廣泛認(rèn)為是一個(gè)干細(xì)胞的標(biāo)志物，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。這個(gè)基因?qū)儆谝胰┟摎涿讣易澹珹LDH1A1 的過表達(dá)和胃癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，乳酸可誘導(dǎo)ALDH1A1 的表達(dá)量提高9 倍以上，從而提高B 淋巴母細(xì)胞的致瘤性。另外，上調(diào)較多的基因包括Oct4、EpCAM、KLF4 和Nestin 均為與細(xì)胞干性相關(guān)的促瘤基因。EpCAM 一直被用作淋巴瘤診斷的標(biāo)志物之一[18]；Nestin 是一種著名的干細(xì)胞標(biāo)志基因，在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌和淋巴瘤中，它與細(xì)胞的增殖、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移均相關(guān)。Nestin 在B 淋巴母細(xì)胞中的上調(diào)能使其獲得干細(xì)胞的特性。Oct4 和KLF4 均為轉(zhuǎn)錄因子，能誘導(dǎo)“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”的形成，且在乳酸的作用下均上調(diào)，增加了細(xì)胞的干性和致瘤性。因此將培養(yǎng)液的pH 調(diào)到6.0 左右，可能用作誘導(dǎo)“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”的一個(gè)新的方法，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，乳酸誘導(dǎo)無致瘤性的B 淋巴母細(xì)胞去分化，通過上調(diào)ALDH1A1、Nestin、Oct4、KLF4 和EpCAM 等促癌基因的表達(dá)，增強(qiáng)其致瘤性。本研究闡明了乳酸可能對基因進(jìn)行重編程，為乳酸誘導(dǎo)細(xì)胞的致瘤性提供新的思路。