張潔莉，王麗霞，安靜，劉丹丹，翟文霞，吳琳乾，李妤蓉

邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 邢臺(tái) 054000

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是臨床上最常見(jiàn)的致病菌之一，常在機(jī)體免疫力低下時(shí)導(dǎo)致各種急慢性感染，其院內(nèi)感染發(fā)生率在革蘭氏陰性菌中居前列，并呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。銅綠假單胞菌多重耐藥導(dǎo)致臨床抗感染治療難度增加，而其感染的發(fā)生發(fā)展與其表達(dá)的多種毒力因子密切相關(guān)[2]。研究證實(shí)，Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)參與了銅綠假單胞菌的感染和致病過(guò)程，且T3SS分泌的多種效應(yīng)蛋白多與急性感染有關(guān)。ExoU、ExoS、ExoT、ExoY是T3SS分泌的4種主要效應(yīng)蛋白，特別是ExoU和ExoS的表達(dá)水平與感染和炎癥的程度相關(guān)，對(duì)預(yù)后有顯著影響[3]。此外，群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing，QS)廣泛存在于銅綠假單胞菌，對(duì)其多種毒力基因表達(dá)有調(diào)控作用。Las系統(tǒng)是QS的重要組成部分，可調(diào)控外毒素A(exotoxin A)、LasA蛋白酶、堿性蛋白酶(alkaline protease)等多種蛋白及酶的合成，與細(xì)菌的致病性和耐藥性密切相關(guān)[4]。因此，抑制QS進(jìn)而對(duì)毒力因子釋放進(jìn)行有效調(diào)控，已成為銅綠假單胞菌感染治療的重要研究方向。本研究通過(guò)分析銅綠假單胞菌中exoU、lasI基因表達(dá)差異與其耐藥性之間的關(guān)系，以期為臨床合理用藥及抗感染藥物研發(fā)提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

選取2019年6月—2020年12月邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院收集和分離的640株銅綠假單胞菌，分別來(lái)自痰液標(biāo)本(330株)、血液標(biāo)本(142株)、膿液標(biāo)本(97株)、穿刺液標(biāo)本(23株)、引流液標(biāo)本(36株)、膽汁標(biāo)本(12株)。所有標(biāo)本均嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行驗(yàn)證，且將重復(fù)和不合格樣本剔除。陽(yáng)性質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853(購(gòu)自溫州市康泰生物科技有限公司)。

1.2 菌株鑒定與藥敏試驗(yàn)

采用BD PhoenixTM-100全自動(dòng)微生物分析儀(美國(guó)BD公司)鑒定所有銅綠假單胞菌。采用瓊脂稀釋法檢測(cè)銅綠假單胞菌對(duì)常用抗生素的敏感性，藥敏試驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果均參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株DNA作為模板，并根據(jù)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物序列均參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并委托上海華大基因科技有限公司合成制備，引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)體系共25 μL，主要包括2.5 μL 10×PCR緩沖液、2.5 μL dNTP混合物，以及濃度均為10 mmol/L的0.5 μL上游引物和0.5 μL下游引物，另加入16.9 μL無(wú)菌雙蒸水、濃度為5 U/μL的0.1 μL DNA聚合酶和2.0 μL DNA模板。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 1 min，退火30 s(exoU、exoS、lasI退火溫度分別為58 ℃、54 ℃、56 ℃)，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行凝膠成像并觀察。

1.4 熒光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)檢測(cè)毒力基因表達(dá)

參照RNA提取試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)說(shuō)明書(shū)提取銅綠假單胞菌總RNA，取1 μg用 PrimeScript RT reagent Kit(日本TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后按SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光qPCR，內(nèi)參為rpoD基因。采用2-ΔΔct計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量(relative quantification，RQ)[6]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 lasI、exoS、exoU基因片段擴(kuò)增成功

利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)lasI、exoS、exoU基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，目的基因條帶大小正確，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

2.2 不同來(lái)源銅綠假單胞菌中各基因分布特征

640株銅綠假單胞菌主要來(lái)自痰液(51.56%)、血液(22.19%)及膿液(15.16%)標(biāo)本。exoS+/exoU-基因組合在各標(biāo)本中均檢出率最高，其在痰液、血液和膿液標(biāo)本中的檢出率分別為56.97%(188/330)、71.83%(102/142)和67.01%(65/97)。結(jié)果如表2所示。

2.3 不同來(lái)源銅綠假單胞菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，640株銅綠假單胞菌對(duì)10種抗菌藥物均有不同程度的耐藥，且痰液來(lái)源的菌株對(duì)亞胺培南的耐藥率高于血液、膿液及其他來(lái)源的菌株(P<0.001)。結(jié)果如表3所示。

M: Marker; Lane 1: lasI gene-negative control; Lanes 2-4: lasI gene; Lane 5: exoS gene-negative control; Lanes 6-8: exoS gene; Lane 9: exoU gene-negative control; Lanes 10-12: exoU gene.

表2 不同標(biāo)本來(lái)源銅綠假單胞菌中各基因分布特征

表3 不同標(biāo)本來(lái)源銅綠假單胞菌的耐藥性比較

2.4 不同基因型銅綠假單胞菌的耐藥性比較

攜帶exoU銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南，慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星等氨基糖苷類(lèi)，左氧氟沙星和環(huán)丙沙星等氟喹諾酮類(lèi)，以及阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物均具有較高的耐藥率(P<0.001)，攜帶exoS的銅綠假單胞菌對(duì)氨曲南具有較高的耐藥率(P<0.05)，lasI缺失的銅綠假單胞菌對(duì)各抗菌藥物的耐藥率顯著降低(P<0.001)。結(jié)果如表4所示。

2.5 基因表達(dá)水平及相關(guān)性分析

實(shí)時(shí)熒光qPCR結(jié)果顯示，exoU缺失(exoU-)后，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因ptrA、exsA的表達(dá)水平較于exoU未缺失(exoU+)下降(P=0.025，0.013，見(jiàn)圖2)；172株攜帶exoU的銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因ptrA、exsA的表達(dá)水平與exoU的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.645，r2=0.416，P<0.001；r=-0.587，r2=0.345，P<0.001，詳見(jiàn)圖3)；423株攜帶exoS的銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因ptrA、exsA的表達(dá)水平與exoS的表達(dá)水平也呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.618，r2=0.382，P<0.001；r=-0.532，r2=0.283，P<0.001，詳見(jiàn)圖4)。lasI缺失后，其下游毒力基因lasA、aprX表達(dá)水平顯著降低(P<0.001，見(jiàn)圖5)，且lasA、aprX的表達(dá)水平與lasI表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.489，r2=0.239，P<0.001；r=0.512，r2=0.262，P<0.001)。具體結(jié)果如圖6所示。

表4 不同基因型銅綠假單胞菌的耐藥性比較

圖2 exoU+與exoU-銅綠假單胞菌中ptrA和exsA的表達(dá)水平

圖3 ptrA、exsA表達(dá)水平與exoU表達(dá)水平的相關(guān)性

圖4 ptrA、exsA表達(dá)水平與exoS表達(dá)水平的相關(guān)性

*P<0.001 compared with lasI+ group.

3 討論

銅綠假單胞菌是廣泛存在于人體皮膚以及呼吸道的致病菌，在機(jī)體抵抗力低下時(shí)可誘發(fā)感染和炎癥反應(yīng)。隨著抗生素的大量和廣泛使用，其耐藥性呈上升趨勢(shì)，且耐藥機(jī)制較為復(fù)雜[7]。T3SS作為銅綠假單胞菌與外界交流、獲取所需養(yǎng)分及將分泌的毒性蛋白傳輸至外界環(huán)境的重要途徑，可分泌包括ExoU、ExoS在內(nèi)的多種效應(yīng)蛋白，從而發(fā)揮致病作用[8]。 ExoU 能導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生快速損傷和壞死，且具有腺苷酸環(huán)化酶及磷脂酶活性，是T3SS中最具破壞性的細(xì)菌毒素[9]。ExoS可顯著抑制宿主細(xì)胞的吞噬作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其毒力僅次于ExoU，還具有二磷酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移酶活性[10]。這兩種主要毒力因子的表達(dá)對(duì)感染的嚴(yán)重程度和預(yù)后具有決定性作用。本研究的640株銅綠假單胞菌主要來(lái)源于痰液(51.56%)、血液(22.19%)及膿液(15.16%)標(biāo)本。exoS+/exoU-基因組合在各標(biāo)本中均檢出率最高，其在痰液、血液和膿液標(biāo)本中的檢出率分別為56.97%(188/330)、71.83%(102/142)和67.01%(65/97)，提示銅綠假單胞菌毒力基因表達(dá)與感染部位之間無(wú)明顯的相關(guān)性。

圖6 lasA、aprX表達(dá)水平與lasI表達(dá)水平的相關(guān)性

國(guó)外研究表明，ExoU不僅會(huì)引起宿主細(xì)胞發(fā)生損傷，使感染病灶中的銅綠假單胞菌大量繁殖，還能促使其他條件致病菌引發(fā)進(jìn)一步的雙重感染，從而加重病情，影響預(yù)后[11-12]。細(xì)菌毒力基因常與其耐藥性密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，640株銅綠假單胞菌對(duì)10種抗菌藥物均有不同程度的耐藥，且痰液來(lái)源的銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥率高于血液、膿液及其他來(lái)源的菌株(P<0.001)。攜帶exoU的銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南，慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星等氨基糖苷類(lèi)，左氧氟沙星和環(huán)丙沙星等氟喹諾酮類(lèi)，以及阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物均具有較高的耐藥率(P<0.001)，耐藥率40%以上；攜帶exoS的銅綠假單胞菌對(duì)氨曲南具有較高的耐藥率(P<0.05)。攜帶exoS或exoU的銅綠假單胞菌對(duì)哌拉西林/他唑巴坦及頭孢吡肟的耐藥率均低于20%，可考慮將此類(lèi)藥物作為本地區(qū)銅綠假單胞菌感染的經(jīng)驗(yàn)性治療藥物。值得關(guān)注的是，很少有研究報(bào)道攜帶exoU的銅綠假單胞菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)的耐藥性，這可能是因?yàn)椴煌貐^(qū)的抗生素使用習(xí)慣不同，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性存在一定的差異，這可能與細(xì)菌基因位點(diǎn)變異有關(guān)，但具體機(jī)制須進(jìn)一步探討[13]。目前，關(guān)于T3SS分泌的效應(yīng)蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究不多。銅綠假單胞菌中T3SS基因表達(dá)主要受轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白ExsA的調(diào)控，而PtrA是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶exoU或exoS基因的銅綠假單胞菌中轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因ptrA、exsA的表達(dá)與exoU或exoS的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)。ptrA基因過(guò)表達(dá)時(shí)，會(huì)明顯抑制exoU、exoS的表達(dá)，且exsA的表達(dá)也明顯下降，提示PtrA可能通過(guò)調(diào)節(jié)ExsA表達(dá)而影響ExoU、ExoS等的表達(dá)，從而推測(cè)T3SS可能通過(guò)調(diào)控ptrA等負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)效應(yīng)蛋白的表達(dá)[15]。

銅綠假單胞菌QS具有調(diào)控300多個(gè)毒力基因的能力，與細(xì)菌生物被膜形成及細(xì)菌致病性密切相關(guān)。研究證實(shí)，抑制銅綠假單胞菌QS可有效降低細(xì)菌的致病性及耐藥程度[16]，已成為目前臨床細(xì)菌感染治療及耐藥性研究的重點(diǎn)。Las系統(tǒng)作為QS的重要組成部分，主要由lasI、lasR基因構(gòu)成[17]。稅劍等[18]的研究證實(shí)，缺乏lasI、lasR基因的銅綠假單胞菌的成膜能力顯著下降，甚至不能形成生物膜，從而其對(duì)常規(guī)抗菌藥物的敏感性大大提高。本研究結(jié)果顯示，lasI缺失的銅綠假單胞菌對(duì)各類(lèi)抗菌藥物的耐藥率顯著降低(P<0.001)，與鄂順梅等[19]的研究結(jié)果一致。本文進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，lasI缺失的銅綠假單胞菌下游毒力基因lasA、aprX的表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，且lasA、aprX的表達(dá)水平與lasI表達(dá)水平顯著正相關(guān)(r=0.489，P<0.001；r=0.512，P<0.001)，提示Las系統(tǒng)對(duì)其下游毒力基因具有一定的正反饋調(diào)節(jié)作用。銅綠假單胞菌QS具有級(jí)聯(lián)調(diào)控和反饋機(jī)制：Las系統(tǒng)處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)頂端，在感受到刺激信號(hào)后最先啟動(dòng)激活，并促使lasI表達(dá)上調(diào)。因此，Las系統(tǒng)為QS的正向調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控下游毒力基因的表達(dá)[19-20]。

綜上所述，exoU表達(dá)與銅綠假單胞菌的耐藥性顯著相關(guān)，ptrA可能是exoU表達(dá)的潛在負(fù)調(diào)控基因，而lasI缺失會(huì)明顯抑制銅綠假單胞菌QS毒力基因的表達(dá)及耐藥性的產(chǎn)生。