翁軼瑋，劉秀雯，石書娟，李澤宇，張盈，黃新祥

江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

傷寒沙門菌(Salmonellatyphi，S.typhi)是一種革蘭氏陰性短桿菌，也是一種食源性致病菌。人們攝入被其污染的食物和水后可能會被感染，出現(xiàn)以高熱、全身疼痛、皮膚玫瑰疹、菌血癥、腸道穿孔等為主要癥狀的傷寒熱，若未經及時治療，則致死率較高[1]。人類是傷寒沙門菌的唯一宿主，感染病例遍布全球，尤以發(fā)展中國家最為嚴重，全球每年約有20萬人因感染傷寒沙門菌而死亡[1]。

Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)是傷寒沙門菌的重要毒力因子之一。T3SS1分泌的效應蛋白有助于傷寒沙門菌侵入腸道上皮細胞，隨后被單核-巨噬細胞等吞噬性細胞攝取，在細胞內的囊泡中生存和繁殖，該囊泡被稱為沙門菌液泡(Salmonella-containing vacuole，SCV)[2]。T3SS分泌的效應蛋白對SCV的影響體現(xiàn)在以下兩方面：① T3SS是一種“針樣注射裝置”，其發(fā)揮作用時會對SCV膜產生不同程度的損傷，導致自噬蛋白LC3募集至破損的SCV，進而與自噬受體蛋白結合并泛素化，促進吞噬體與溶酶體結合，從而消滅傷寒沙門菌；② 傷寒沙門菌能利用T3SS進行SCV自噬損傷的修復，促進其自身在細胞內的生存和復制[3-4]。

SopE屬于鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)，通過T3SS1進入宿主腸上皮細胞，激活Rho GTPase，導致肌動蛋白F重塑，引起上皮細胞膜褶皺，從而促進細菌入侵[5-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，SopE的存在增加了傷寒沙門菌胞質的釋放，是早期SCV損傷的主要因素[9]；SopE除了能促進傷寒沙門菌在感染早期于上皮細胞胞內釋放而有利于侵襲外[10]，還可定位于SCV膜表面，促進傷寒沙門菌在細胞內的生存及復制[11]。然而，這些研究均集中于SopE對早期SCV穩(wěn)定性的影響，尚無研究報道其對晚期SCV穩(wěn)定性的影響。因此，本研究探討了傷寒沙門菌侵入巨噬細胞后SopE對其胞內生存能力和晚期SCV穩(wěn)定性的影響，以及SopE能否通過影響自噬而調節(jié)晚期SCV的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒傷寒沙門菌GIFU10007野生株(wild type，WT)和自殺質粒pGMB151由日本岐阜大學醫(yī)學部微生物教研室饋贈；sopE突變株(ΔsopE)、突變株的回補株(ΔsopE/pBAD33-SopE，C-ΔsopE)以及表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的WT、ΔsopE和C-ΔsopE(WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP)等菌株均由本實驗室構建和保存。

1.1.2 主要試劑配制Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基所用的NaCl、蛋白胨、瓊脂為美國Thermo公司生產；瓊脂糖為法國Biowest公司產品；蔗糖為美國Sigma-Aldrich公司產品；BamHⅠ、XbaⅠ和Hind Ⅲ限制性核酸內切酶，T4DNA連接酶，以及DL500、DL1000、DL2000 Marker 為日本TaKaRa公司產品；氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素、質粒小量抽提試劑盒、RIPA裂解液試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、鼠抗β-actin、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG為生工生物工程(上海)股份有限公司產品；THP-1細胞購自中國科學院細胞庫；反轉錄試劑、SYBR染料法熒光定量試劑、2×Taq連接酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；鼠抗LAMP 1和兔抗LC3B購自美國CST公司；兔抗Gal-8、羊抗兔IgG-Cy3、羊抗鼠IgG-TRITC購自武漢愛博泰克(ABclonal)生物科技有限公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自美國Sigma公司。

1.1.3 主要儀器數顯恒溫水浴鍋為上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產品；普通聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀、大型臺式恒溫搖床、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產品；臺式高速冷凍離心機為湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產品；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(CFX96)、電穿孔儀Gene PulserⅩ、水平電泳槽、垂直電泳槽和電轉印槽為美國Bio-Rad公司產品；核酸紫外檢測儀為德國Eppendorf公司產品；超微量分光光度計為美國NanoDrop公司產品；超敏化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、超高分辨活細胞成像系統(tǒng)為美國GE公司產品；全自動凝膠成像系統(tǒng)為上海勤翔科學儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1sopE缺陷變異株(ΔsopE)的構建根據sopE序列，利用Oligo 7軟件設計構建sopE突變株的引物對BF1/BR1和BF2/BR2(見表1)，其中BF1和BR2的5′端加入BamHⅠ酶切位點，具體如表1中下劃線所示。PCR擴增獲得上游和下游同源片段F1、F2；以F1、F2為模板，用BF1、BR2進行PCR擴增，獲得總同源片段F；用BamHⅠ限制性核酸內切酶切割片段F和自殺質粒pGMB151；用T4DNA連接酶連接，連接產物轉化至大腸埃希菌S17，對PCR鑒定的陽性克隆進行測序驗證。將已測序驗證的重組質粒轉化入WT菌株，進而在含氨芐青霉素的LB板上篩選含質粒的菌株，在含5%蔗糖的LB平板上誘導重組，利用BF1/BR2對不同克隆子進行PCR擴增驗證，能在LB普通平板上獲得完全重組并穩(wěn)定傳3代且序列完全正確的第4代菌株，即為ΔsopE菌株。

1.2.2 C-ΔsopE菌株的構建以WT菌株的基因組為模板，利用引物對sopE-F(5′端加入XbaⅠ酶切位點)和sopE-R (5′ 端加入HindⅢ酶切位點)進行 PCR擴增， 獲得回補片段， 用XbaⅠ和HindⅢ消化回補片段和pBAD33載體； T4DNA連接酶連接，轉化入大腸埃希菌DH5α；PCR篩選出陽性克隆子，并提取重組質粒，進行測序驗證。將已測序驗證的重組質粒轉化入ΔsopE菌株，獲得C-ΔsopE菌株。同時，將pBAD33空載體分別轉化入WT和ΔsopE菌株，獲得對照組WT/pBAD33和ΔsopE/pBAD33，以消除添加氯霉素對實驗可能造成的影響。

表1 PCR引物

1.2.3 GFP表達菌株的構建將GFP原核表達質粒pET28-sfGFP電轉入WT/pBAD33、ΔsopE/pBAD33和C-ΔsopE菌株，在含硫酸卡那霉素的LB板上篩選含質粒的菌株，用T7/T7T對不同克隆株進行PCR擴增驗證，最終能擴增出陽性條帶的菌株則為WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株。

1.2.4 巨噬細胞THP-1胞內生存能力實驗使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，將細胞置于37 ℃、CO2體積分數5%的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。調整細胞密度至1×105cells/ mL，將細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中(每孔1 mL細胞懸液)，加入佛波醇乙酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)(終濃度150 ng/mL)誘導分化細胞48 h，貼壁細胞即為巨噬細胞，誘導率約為70%。將WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP、C-ΔsopE/pET28-sfGFP單克隆分別接種于2 mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)過夜，用作種子液。次日，按1∶100比例轉接到20 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，加入20% L-阿拉伯糖誘導蛋白合成，以同樣條件培養(yǎng)至對數生長期(OD600=0.4)，以 4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用RPMI 1640重懸菌體。實驗前1 h，棄去24孔板中的舊培養(yǎng)基，用1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗去殘余PMA，每孔加入1 mL新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基。將細菌按感染復數(multiplicity of infection，MOI)為10∶1加入24孔板，37 ℃、CO2體積分數5%培養(yǎng)1 h，每孔加入100 μg/mL慶大霉素，以同樣條件培養(yǎng)1 h殺死胞外菌。將全部孔數分成2等份，一半孔棄去上清液，用1×PBS洗3次，加入0.5% TritonXTM-100裂解細胞，適當稀釋后涂于含抗生素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，計數平板上菌落數量并乘以稀釋倍數作為T0。余下一半孔棄去1/2培養(yǎng)液，加入1/2新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液(仍為慶大霉素環(huán)境)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用同樣的方法計數菌落數作為T24。T24/T0值代表了細菌在巨噬細胞THP-1內的生存能力。按照此方法進行3次生物學重復實驗。

1.2.5 細胞免疫熒光實驗接種細胞前，將細胞爬片放入24孔板，按1.2.4小節(jié)所述方法感染培養(yǎng)24 h，用1×PBS于搖床中清洗細胞爬片3次，每次5 min。加入300 μL 4%多聚甲醛固定和通透細胞30 min，棄去4%多聚甲醛，用1×PBS清洗4次，每次5 min。用5% BSA室溫封閉45 min，棄去封閉液，與5% BSA稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，用1×PBS清洗4次，每次10 min。與1×TBST稀釋的二抗于室溫避光搖床孵育1 h，用1×PBS清洗4次，每次10 min。用1×TBST稀釋的4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)溶液染核，1×PBS清洗4次，每次10 min。用抗熒光淬滅的封片劑封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內紅色和綠色點狀聚集。

1.2.6 RNA提取及qRT-PCR將細胞按2.5×105cells/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2.5 mL，按1.2.4小節(jié)所述方法感染培養(yǎng)24 h后，每孔加入 167 μL TRIzol，提取總RNA并定量。取1 μg總RNA，用反轉錄試劑盒消化基因組DNA同時反轉錄成cDNA。用自噬特異性引物(見表1)進行qRT-PCR，以β-actin為內參基因，使用相對定量法分析不同基因的mRNA表達水平。每組設置3個平行樣，并進行3次生物學重復實驗。

1.2.7 細胞蛋白提取和蛋白免疫印跡實驗將細胞分別接種于3個細胞培養(yǎng)皿(5×105cells/皿)，培養(yǎng)體積6 mL/皿，按1.2.4小節(jié)所述方法感染培養(yǎng)24 h后，用RIPA裂解液試劑盒裂解提取蛋白質，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮5 min，于4 ℃以 13 000 r/min離心10 min。用SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒制備凝膠，每孔加入15 μL經處理的蛋白質上清液樣本，電泳至目的蛋白充分分離(濃縮膠使用80 V電壓，分離膠使用120 V電壓)。將聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜在甲醇中浸泡20 min，放入1×轉膜緩沖液中平衡2 min，浸潤電轉所用海綿、濾紙，PVDF膜放好位置后插入電轉儀，在250 mA恒流、4 ℃下電轉1 h。電轉后PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃下與一抗孵育過夜，1×TBST洗滌3次，每次10 min，與二抗在室溫下?lián)u床孵育 1 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min。用濾紙將PVDF膜吸干，滴加增強型化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑，在超靈敏化學發(fā)光凝膠顯像系統(tǒng)下進行曝光。

1.3 統(tǒng)計學分析

用Excel表格處理原始數據，采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組之間均數比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 成功構建突變株和回補株

以WT菌株全基因組DNA為模板，BF1/BR1、BF2/BR2為引物對，通過PCR擴增同源重組的上、下游同源臂。結果如圖1A所示，上、下游同源臂F1和F2的片段大小均與理論一致。F1和F2經純化、回收、等比例混合后，用作引物對BF1和BR2 擴增的模板，可擴增出理論長度為1 027 bp的DNA片段(見圖1B)。利用分子克隆技術將該DNA片段克隆入自殺質粒pGMB151，并轉化入WT菌株，進行同源重組以敲除sopE。使用PCR技術對不同克隆子進行驗證，發(fā)現(xiàn)1株擴增出F片段且能在LB培養(yǎng)板上穩(wěn)定傳3代的菌株，表明其獲得了穩(wěn)定重組(見圖1C)。該重組子經測序驗證，證明為ΔsopE菌株。

以sopE-F/sopE-R為引物，通過PCR擴增獲得同源片段S2。利用分子克隆技術將該DNA片段克隆入蛋白表達質粒pBAD33，并轉化入ΔsopE菌株。使用PCR技術對不同克隆子進行驗證，發(fā)現(xiàn)1株擴增出S2片段(見圖1D)，測序驗證結果表明C-ΔsopE菌株構建成功。同時，電泳結果顯示WT/pBAD33和ΔsopE/pBAD33菌株均構建成功(見圖1E、1F)。

M: DNA marker; +: recombinant plasmid as template; -: deionized water as template;

2.2 成功構建GFP表達菌株

將pET28-sfGFP直接電轉入WT/pBAD33、ΔsopE/pBAD33、C-ΔsopE菌株，以T7/T7T為引物進行PCR擴增。電泳結果顯示，pET28-sfGFP成功電轉(見圖2)，表明GFP表達菌株WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP構建成功。

M: DNA marker; 1-3: PCR products of positive wild strains; 4-6: PCR product of positive defective strain; 7-8: PCR product of positive complement strain; -: pure water as negative control; +: pure pET28-sfGFP plasmid.

2.3 SopE促進傷寒沙門菌的胞內生存能力

為了研究傷寒沙門菌sopE基因缺失對其在巨噬細胞THP-1內生存能力的影響，用WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株進行THP-1胞內生存實驗。結果顯示，感染24 h后，ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株的胞內生存能力比WT/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株明顯降低，而C-ΔsopE/pET28-sfGFP 菌株的胞內生存能力與ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株相比有所回升(見圖3)，表明SopE能夠提高傷寒沙門菌在巨噬細胞內的生存能力。

2.4 SopE可能增強晚期SCV的穩(wěn)定性

為了研究sopE基因缺失對巨噬細胞內晚期SCV穩(wěn)定性的影響，在WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株感染巨噬細胞24 h時進行免疫熒光實驗，將LAMP1和GAL8與菌株共定位。結果顯示，感染24 h時WT/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株在巨噬細胞內形成的SCV膜上的LAMP1蛋白熒光強度，較于ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株增強不明顯，但GAL8蛋白熒光強度顯著減弱(見圖4)。應用qRT-PCR對WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株中的目的基因LAMP1、GAL8進行檢測，目的基因mRNA水平的變化與其在蛋白水平的熒光檢測結果一致(見圖5A)。結果表明，sopE缺陷株SCV的穩(wěn)定性下降，SopE可能增強了晚期SCV的穩(wěn)定性。

Ⅰ: WT/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅱ: ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅲ: C-ΔsopE/pET28-sfGFP strain.

Ⅰ: WT/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅱ: ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅲ: C-ΔsopE/pET28-sfGFP strain. Blue fluorescence represents nuclear, red fluorescence represents LAMP1 and GAL8, and green fluorescence represents bacteria. The magnification is 600×.

2.5 SopE可能在感染晚期抑制自噬

LC3在自噬的成核和延伸階段發(fā)揮作用，是自噬體膜上的標志性蛋白。自噬受體蛋白與LC3結合，通過泛素化使自噬體與溶酶體結合[10]。為了研究sopE基因缺失對巨噬細胞內晚期SCV穩(wěn)定性的影響是否與自噬相關，提取WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株感染巨噬細胞24 h時的總RNA進行qRT-PCR，并提取總蛋白進行蛋白免疫印跡實驗。qRT-PCR結果顯示，WT/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株感染巨噬細胞24 h后，LC3B在mRNA水平的表達顯著低于ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株感染組(見圖5A)。蛋白免疫印跡結果顯示，WT/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株感染細胞后，LC3B蛋白的表達水平也顯著低于ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株感染組(見圖5B)。結果提示，SopE可能在感染晚期抑制自噬。

Ⅰ: WT/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅱ: ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅲ: C-ΔsopE/pET28-sfGFP strain.

3 討論

傷寒沙門菌通過沙門菌毒力島1(Salmonellapathogenicity island 1，SPI-1)編碼的T3SS1效應蛋白入侵腸道上皮細胞，被單核-巨噬細胞吞噬后在巨噬細胞內形成SCV，利用SPI-2編碼的T3SS2效應蛋白在SCV中生存和復制[12]。傷寒沙門菌被吞噬包裹后，迅速募集Rab5、PI3P、EEA1等早期膜標記形成初期SCV，進而棄去早期標記并募集晚期膜標記Rab7、LAMP1等形成晚期SCV，同時近核移動并酸化，促進T3SS2效應蛋白的產生，通過囊泡運輸，不斷與無水解酶的晚期內體及溶酶體融合，形成成熟的SCV，從而促進傷寒沙門菌在細胞內的生存和復制[13-16]。LAMP1不僅是晚期SCV的標記，還與SCV膜的完整性相關。晚期SCV會不斷募集無水解酶的內體和溶酶體與之融合，確保SCV的穩(wěn)定性，但此動態(tài)變化也會導致SCV的破損。一旦破損，GAL8會迅速識別并在破損處聚集，通過自噬消滅傷寒沙門菌[17-18]。SCV的穩(wěn)定性對傷寒沙門菌在巨噬細胞內的生存和復制至關重要。被傷寒沙門菌感染后，機體可以誘導自噬，這在消除細菌中起關鍵作用。SCV中的傷寒沙門菌能夠通過T3SS將效應蛋白注入宿主細胞胞質中，使SCV膜產生大小不一的小孔，導致SCV膜破損甚至破裂，從而導致傷寒沙門菌進入胞質。這些傷寒沙門菌和破損的SCV會被泛素化，招募自噬相關蛋白，被溶酶體吞噬消滅[19-20]。與此同時，傷寒沙門菌也進化出了逃逸自噬的能力。研究發(fā)現(xiàn)，T3SS1效應蛋白SopB 能募集Rab5和PI3P至SCV膜，促進LAMP1及Rab7的募集，并降低早期SCV膜表面的負電荷，抑制SCV與溶酶體融合，增強早期SCV的穩(wěn)定性[21-22]。T3SS1效應蛋白SopF可與ATP6V0C結合，從而阻斷v-ATPase-ATG16L1的相互作用，抑制機體異體自噬，但不影響非選擇性自噬[23-25]。

本研究制備了傷寒沙門菌SPI-1效應蛋白SopE的缺陷株和回補株，通過胞內生存能力實驗發(fā)現(xiàn)SopE在感染晚期能夠提高傷寒沙門菌在巨噬細胞THP-1內的生存能力。通過細胞免疫熒光和qRT-PCR實驗，發(fā)現(xiàn)sopE缺陷株的SCV穩(wěn)定性下降，提示SopE可能促進晚期SCV的穩(wěn)定性。巨噬細胞內自噬相關基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平的實驗結果顯示，SopE可能在感染晚期抑制自噬。綜上所述，傷寒沙門菌SPI-1效應蛋白SopE可能通過影響自噬而調節(jié)晚期SCV的穩(wěn)定性。以往研究發(fā)現(xiàn)，SopE是早期SCV損傷的主要因素，能夠促進傷寒沙門菌在感染早期于上皮細胞胞內釋放，從而有利于侵襲[9]。因此，SopE在感染早期和晚期發(fā)揮的作用可能不盡相同，這為研究傷寒沙門菌效應蛋白的作用提供了新思路，也為后續(xù)深入研究其調控機制奠定了基礎。