彭云娟，傅芬蕊，鐘文，黃麗雯

福建省寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院檢驗科， 福建 寧德 352100

沙門菌是導(dǎo)致人群食物中毒的重要食源性致病菌之一，全球每年約有300萬人死于其所致急性腸胃炎[1]，我國每年約有3億人因其感染而患病[2]。沙門菌的血清型約有2 610 種，其中大多數(shù)具有廣泛致病性[3]。沙門菌通常通過位于毒力島或質(zhì)粒上的毒力基因編碼一系列毒力因子來達到感染宿主的目的，這些毒力因子可相互作用而致病。例如，avrA、ssaQ、sodC1、mgtC、gipA等毒力基因在沙門菌中普遍存在，且部分基因存在水平轉(zhuǎn)移的可能性。近年來，福建省寧德地區(qū)發(fā)生了多起食物中毒事件，其中絕大多數(shù)與沙門菌感染有關(guān)，因此對寧德地區(qū)沙門菌感染的流行病學(xué)特征、分子分型、耐藥性和毒力基因進行分析具有重要意義，但迄今尚無相關(guān)文獻報道。本研究以從寧德地區(qū)分離得到的364株沙門菌作為分析對象，對其流行病學(xué)特征、分子分型、耐藥性和毒力基因進行研究，以期為寧德地區(qū)食源性疾病的溯源和防治提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究中沙門菌菌株均由寧德市各大醫(yī)院于2015—2020年分離獲得，共364株，其中325株來自寧德市醫(yī)院，其余39株分別來自寧德市中醫(yī)院及寧德市人民醫(yī)院。2015年分離獲得65株，2016年分離獲得74株，2017年分離獲得49株，2018年分離獲得55株，2019年分離獲得44株，2020年分離獲得77株。

1.2 試劑和儀器

主要試劑和儀器有SBG增菌液(美國BD)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(英國Oxoid)、HE瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋)、XbaI內(nèi)切酶(美國New England Biolabs)、蛋白酶K(美國Amresco)、診斷血清(丹麥SSI)、藥敏檢測板(上海星佰)、CHEF Mapper脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)儀(美國Bio-Rad)、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)、VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌生化鑒定儀(法國梅里埃)。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。LMQ.C-80EP型高壓蒸汽滅菌鍋由山東新華醫(yī)療器械股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 分離與鑒定將標(biāo)本保存液接種至SBG增菌液，37 ℃孵育24 h，然后分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和HE瓊脂培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h。查看細(xì)菌的生長狀態(tài)，使用VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀對可疑菌落進行菌種鑒定，獲得沙門菌屬。

1.3.2 血清分型選取鑒定為沙門菌的菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上進行單個菌落傳代，采用沙門菌檢測血清進行O相凝集，采用Swarm瓊脂對菌落進行H相凝集及鞭毛誘導(dǎo)，以生理鹽水作為空白對照，根據(jù)Kauffmann-White表確定血清型。

1.3.3 耐藥性分析按世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的K-B紙片擴散法對沙門菌進行藥敏試驗。首先制備接種菌液，制作接種平板，貼紙片并孵育。培養(yǎng)后將平板取出，用游標(biāo)卡尺測定抑菌環(huán)直徑，根據(jù)抑菌圈直徑的大小判斷藥敏試驗結(jié)果，以大腸埃希菌(ATCC 25922)為質(zhì)控菌株。

1.3.4 PFGE分型[4]參照中國細(xì)菌性傳染病分子分型實驗室監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)(PulseNet China)中的沙門菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作程序，以沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812作為PFGE分子量標(biāo)準(zhǔn)，將沙門菌密度調(diào)整為4.5麥?zhǔn)蠞岫龋瞥杉?xì)菌膠塊，再裂解細(xì)菌，洗膠塊，選用XbaI內(nèi)切酶37 ℃酶切3 h，電泳19 h，電泳液溫度14 ℃。電泳結(jié)束后，用GelRed對膠塊進行染色，去離子水洗脫，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用BioNumerics 7.6軟件進行聚類分析，非加權(quán)配對算術(shù)平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA)進行聚類圖構(gòu)建，最優(yōu)化值和條帶位置差異容許度均設(shè)定為1.5%。

1.3.5 毒力基因檢測參照文獻[3]，合成9對擴增引物，用以檢測沙門菌的9個毒力基因。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列、擴增片段大小如表1所示。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)體系(25 μL)：10×Taq Buffer [含(NH4)2SO4和Mg2+] 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl21.5 μL、2 mmol/L dNTP Mix 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，之后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照。

表1 毒力基因檢測的擴增引物[3]

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗進行分析，P<0.05代表有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 364株沙門菌的流行病學(xué)分析

本研究共分離獲得364株沙門菌。流行病學(xué)分析結(jié)果顯示，男性沙門菌感染率顯著高于女性(P<0.05)，0～10歲組人群感染率顯著高于其他年齡組(P<0.05)，農(nóng)村人群感染率顯著高于城市人群(P<0.05)。結(jié)果具體如表2所示。

2.2 364株沙門菌的血清分型

對364株沙門菌進行血清分型，共分出22個血清型。其中：鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、斯坦利沙門菌占比居前3位，分別為57.42%、16.21%、6.87%，為主要血清型。結(jié)果具體如表3所示。

表2 364株沙門菌的流行病學(xué)分析

2.3 沙門菌主要血清型對部分抗生素的耐藥性分析

對鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、斯坦利沙門菌進行耐藥性分析。結(jié)果顯示，除環(huán)丙沙星外，鼠傷寒沙門菌對其他抗生素均有一定的耐藥性，且對氨芐西林、磺胺異噁唑、四環(huán)素、鏈霉素的耐藥率較高；腸炎沙門菌對氨芐西林、磺胺異噁唑、四環(huán)素、鏈霉素、甲氧芐啶的耐藥率較高；斯坦利沙門菌對試驗用抗生素的耐藥率均未超過50%，對頭孢他啶、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢吡肟未表現(xiàn)出耐藥性。結(jié)果具體如表4所示。

表3 364株沙門菌的血清分型

表4 沙門菌主要血清型的耐藥性分析

2.4 364株沙門菌的PFGE分子分型特征

經(jīng)聚類分析PFGE圖譜，結(jié)果顯示364株沙門菌共有212種帶型。按時間分布如下：1～3月 6.25%、4～6月19.53%、7～9月40.60%、10～12月33.60%。按地區(qū)分布如下：蕉城區(qū)18.25%、東僑區(qū)14.35%、漳灣區(qū)12.58%、金涵區(qū)39.64%、古田縣8.45%、霞浦縣4.26%、其他區(qū)域2.47%。按人群年齡結(jié)構(gòu)分布如下：≤1歲組28.30%，1～2歲組24.18%，2～8歲組20.88%，8～18歲組0.82%，18～50歲組9.89%，>50歲組15.93%。帶型相似度為44.52%～100.00%，優(yōu)勢帶型為B53，共23株，且全部為腸炎沙門菌。84株鼠傷寒沙門菌共分離出25種帶型，帶型相似度為92.45%；79株腸炎沙門菌共分離出38種帶型，帶型相似度高達98.64%，其中2018年的19株腸炎沙門菌帶型相似度為100.00%，高度同源。結(jié)果具體如圖1所示。

2.5 364株沙門菌毒力基因檢測結(jié)果

對364株沙門菌進行毒力基因檢測，結(jié)果顯示avrA、ssaQ、sodC1、mgtC、gipA的攜帶率均為100.00%，ssiD、sopE、sopB、spvC的攜帶率分別為90.66%、 94.23%、 92.03%、 63.74%(詳見表5)。

圖1 364株沙門菌的PFGE分子分型特征

表5 364株沙門菌毒力基因檢測結(jié)果

3 討論

沙門菌是導(dǎo)致人類食物中毒和細(xì)菌性感染性腹瀉的主要病原菌之一，且已演化出一系列逃逸宿主天然免疫應(yīng)答的策略[5-6]。本研究針對從福建省寧德地區(qū)近5年來分離獲得的364株沙門菌的流行病學(xué)資料進行分析，發(fā)現(xiàn)男性沙門菌感染率顯著高于女性(P<0.05)，這與李幗寧等[7]的研究結(jié)論一致。其原因可能與男性，特別是男性兒童較易嘗試和接觸不潔凈的食物有關(guān)。同時，0～10歲人群的感染率遠遠高于其他年齡段人群(P<0.05)，構(gòu)成比超過2/3，提示兒童是沙門菌的主要易感人群，應(yīng)對此予以足夠重視并重點保護。其中，又以2歲以下幼兒的感染率最高，構(gòu)成比接近40%。這可能是因為幼兒腸道免疫功能未完全發(fā)育成熟，對細(xì)菌等致病微生物的抵抗力較弱，更容易發(fā)生腸道傳染病[1]。農(nóng)村人群的沙門菌感染率顯著高于城市人群(P<0.05)，這可能與農(nóng)村暴露于自然外環(huán)境的機會更多，食物和水源更易受動物糞便等污物的污染，衛(wèi)生條件較于城市仍較差，且與牲畜等動物接觸機會較多有關(guān)。對沙門菌的基因分型進行分析，364株沙門菌共分離出212種帶型，顯示出寧德地區(qū)沙門菌的遺傳多樣性，鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌的帶型相似度均在90%以上，顯示出高度同源性。腸炎沙門菌的帶型相似度高達98.64%，表明近5年來寧德地區(qū)發(fā)生的食物中毒較大可能來源于同一分子分型的腸炎沙門菌感染，應(yīng)引起相關(guān)部門的高度重視，可以此為依據(jù)進行溯源追蹤研究，避免腸炎沙門菌的暴發(fā)感染。

對364株沙門菌的血清分型進行分析，結(jié)果顯示22個血清型中鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、斯坦利沙門菌占比位居前3位，與世界衛(wèi)生組織全球沙門菌監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示的趨勢[8]基本相符。高紅梅等[9]曾對我國部分地區(qū)2014—2018年腹瀉患者的監(jiān)測結(jié)果進行分析，結(jié)果顯示腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌在非傷寒沙門菌血清型中占比最高，與本研究結(jié)果一致。邱玉鋒等[10]對福建省部分地區(qū)2010—2016年腹瀉患者的菌株血清型進行分析，結(jié)果顯示腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌也位居前兩位。此外，本研究中斯坦利沙門菌的分離率也較高，有資料顯示該血清分型的沙門菌曾在武漢等地的腹瀉患者中顯示出流行趨勢[11]。李幗寧等[7]對沈陽市康平縣進行沙門菌流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示斯坦利沙門菌的分離率較高，達23.46%，本研究中該血清分型的分離率為6.87%，顯著低于康平縣的數(shù)據(jù)，但依然在血清型分析中居第3位。

分析沙門菌的3種主要血清型對主要抗生素的耐藥性，結(jié)果顯示沙門菌對第3、4代頭孢菌素有較高的敏感率，可作為治療沙門菌感染的首選藥物。對四環(huán)素、氨芐西林、磺胺異噁唑、鏈霉素、甲氧芐啶顯示出較高的耐藥率，可能與沙門菌屬中許多菌株共同存在的耐藥基因島SGI1有關(guān)[12]。一直以來，氨芐西林、磺胺異噁唑被認(rèn)為是治療沙門菌感染的有效藥物，但不合理使用抗生素情況的廣泛存在，導(dǎo)致沙門菌對其耐藥性越來越強，并表現(xiàn)出來回波動的特點[13-14]。本研究還顯示，腸炎沙門菌對抗生素的耐藥性總體上略高于鼠傷寒沙門菌和斯坦利沙門菌。結(jié)合寧德地區(qū)沙門菌的基因分型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌的帶型相似度極高，有可能在該地區(qū)作為最主要血清型遠超5年，在長期臨床治療中該血清型對氨芐西林等藥物表現(xiàn)了較強的耐藥性。這提示在未進行沙門菌血清型分析之前，可優(yōu)先選用腸炎沙門菌耐藥性較低的藥物(如頭孢他啶)進行治療，可降低初次抗菌藥物使用即耐藥的概率。

沙門菌的致病性是由其所攜帶的大量毒力因子(結(jié)構(gòu)性毒力因子、腸毒素、毒力島及Ⅲ型分泌系統(tǒng)等)的相互作用所致，與其毒力相關(guān)的基因在沙門菌中普遍存在，且某些基因存在水平轉(zhuǎn)移的可能性[15-16]。本研究結(jié)果顯示，寧德地區(qū)沙門菌毒力基因avrA、ssaQ、sodC1、mgtC、gipA、ssiD、sopE、sopB的攜帶率均在90.00%以上，只有spvC的攜帶率較低，但也達到了63.74%。有研究曾對2008—2012年上海市腸炎沙門菌分離株的毒力基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)毒力基因sopE、avrA、spvC的攜帶率分別為 100.0%、98.9%、78.9%[17]，與本研究的結(jié)果接近。肖蕊等[18]對62株食源性沙門菌分離株的毒力基因進行檢測，共檢測出mogA、ssel、mgtC、siiE、sopB5種毒力基因，其中mgtC、sopB的攜帶率分別為75.81%和51.61%。寧德地區(qū)沙門菌的毒力基因攜帶率均較高，可作為宿主溯源的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為該地區(qū)細(xì)菌致病性機制研究提供參考。

綜上所述，福建省寧德地區(qū)沙門菌感染人群集中在10歲以下兒童，男性高發(fā)，具有一定的遺傳多樣性，且毒力基因的攜帶率較高，相關(guān)部門應(yīng)對此予以重點關(guān)注。