張 森，湯德元，曾智勇，王 彬，黃 濤，楊志剛，晏仁潭，韓超逸，陳閶崢，羅 柳 (貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV) 屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科水痘病毒屬，是偽狂犬病(pseudorabies,PR)的病原。該病毒可引起豬產(chǎn)生呼吸道癥狀、神經(jīng)癥狀和繁殖障礙等癥狀，豬是PRV的主要易感動物，是PRV最重要的傳染源之一，其他哺乳動物以及野生動物感染后均呈致死性感染[1]。大量研究表明：大多皰疹病毒可潛伏感染于神經(jīng)中，其中三叉神經(jīng)節(jié)(TG)是PRV潛伏感染的關(guān)鍵部位[2]。TG細胞是包括PRV等α皰疹病毒的重要靶細胞，有研究表明TG細胞與其他部位的原代細胞相比對PRV感染誘導的細胞凋亡具有更強的抵抗力，說明PRV感染TG細胞可能存在不同的抑制細胞凋亡機制[3]。

磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路發(fā)現(xiàn)于20世紀80年代初期，該通路主要由PI3K、Ser/Thr蛋白激酶兩部分組成。PI3K/Akt信號通路高度保守，其激活通過多步過程嚴格控制，該通路存在于絕大多數(shù)真核細胞中，是機體最重要的信號通路之一[4]。PI3K/Akt信號通路在抑制細胞凋亡、誘發(fā)癌癥、調(diào)控機體免疫及炎癥反應(yīng)、促進細胞增殖并抑制細胞分化中具有重要作用，大多數(shù)病毒感染后會誘導PI3K/Akt信號通路發(fā)揮其特定作用[5]。大量研究表明，皰疹病毒體外感染會誘導細胞PI3K/Akt信號通路激活而產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)。例如皰疹病毒科中的誘發(fā)癌癥的EBV可通過PI3K/Akt信號通路誘導HIF-1α的分泌與合成，從而誘導胃癌的發(fā)生[6]。而KIM等[7]認為，抑制PI3K/Akt信號通路可誘導由EBV引起的胃癌細胞凋亡，為胃癌的控制與治療提供了一個新的思路。

TG細胞是皰疹病毒感染的重要靶細胞，有研究[8-9]證明TG細胞對PRV感染有一種特殊的抵抗力，主要體現(xiàn)在感染后可推遲發(fā)生細胞病變效應(yīng)(CPE)時間，這一點同樣在本實驗室前期研究中已被證明[9]。目前PRV感染細胞或機體調(diào)控PI3K/Akt等信號通路的機制有一定研究，而PRV感染TG細胞所誘導的信號通路變化機制以及調(diào)控過程尚不明確，TG細胞是PRV感染的特殊靶細胞，PRV感染TG細胞的過程可能與其他細胞相比有所不同。為了探究PRV感染TG細胞對PI3K/Akt信號通路的影響以及PI3K/Akt是否在PRV感染后抑制TG細胞的凋亡中發(fā)揮作用，本試驗以小鼠原代TG細胞為模型，探究PRV感染TG細胞后PI3K/Akt信號通路的激活規(guī)律及所調(diào)控的生物學作用，為進一步揭示PRV潛伏感染TG細胞的機理提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和病毒5～7周齡SPF級成年小鼠購自重慶騰鑫生物公司；PRV Guizhou-DY株由本實驗室分離、鑒定和保存。

1.2 主要試劑及耗材胎牛血清(FBS)、B-27、DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司；神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自上海源培生物公司；多聚賴氨酸(D型)、0.25% 胰蛋白酶、AlexaFluor 555標記山羊抗兔IgG購自上海生工生物工程有限公司；山羊血清、膠原蛋白酶Ⅰ、DAPI等購自北京索萊寶生物有限公司；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa(大連)；FastSYBR Mixture購自康為世紀生物科技有限公司；BCA Protein Quantification Kit購自諾唯贊生物科技有限公司；Anti-Pseudorabies Virus抗體(ab3534)購自Abcam公司;兔抗鼠PI3K抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體購自CST(Cell Signaling Technology)；β-Actin抗體購自上海愛必信生物科技有限公司；LY294002、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒以及ECL化學發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)細胞所用耗材均購自Corning;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計與合成于NCBI分別查找PI3K、Akt、GAPDH相關(guān)基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計引物(表1)，引物于擎科生物科技有限公司合成。

表1 擴增目的基因的引物序列

1.4 小鼠TG細胞原代培養(yǎng)根據(jù)實驗室前期研究[9]以及參考文獻[10]方法進行優(yōu)化，培養(yǎng)小鼠原代TG細胞。具體方法:取若干只成年小鼠，經(jīng)麻醉后斷頭處死，無菌操作取兩側(cè)TG置于預冷后的PBS中，去除周圍結(jié)締組織后剪碎，加入膠原蛋白酶I于37℃消化40 min，后加入含EDTA的胰蛋白酶于37℃消化10 min。消化后加入FBS終止消化，并用無菌巴斯德吸管反復吹打，將其吹打混勻后經(jīng)70 μm 細胞濾器過濾并離心去除上清液，加入含10% FBS、青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基反復吹打混勻，放入先前準備的涂過多聚賴氨酸(D型)的6孔板中，于37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h后待細胞貼壁將培養(yǎng)液更換為含2% B-27、10% FBS、青鏈霉素雙抗的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基，3 d后換半液，待培養(yǎng)至5～7 d用于下一步試驗。

1.5 RT-qPCR檢測PRV感染TG細胞后不同時間段PI3K、Akt mRNA表達水平用1 MOI PRV感染TG細胞后，利用Trizol法分別提取不同時間段TG細胞中總mRNA，以未攻毒細胞作為對照組，嚴格按照試劑盒說明書進行提取，利用超微量紫外分光光度計測定所提取mRNA濃度及D值。將所提RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再次測定濃度與D值。將cDNA濃度稀釋后以其為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系：2×Fast SYBR Mixture 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預變性20 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，共計40個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線分析以驗證其特異性。重復試驗3次，并根據(jù)計算公式2-△△Ct法計算PRV感染TG細胞后不同時間段PI3K、Akt mRNA的相對表達含量。

1.6 間接免疫熒光試驗(IFA)將TG細胞培養(yǎng)于細胞爬片中，待細胞匯合至70%時對其進行攻毒，以未攻毒TG細胞為對照組，用PBS輕洗1次，加入4%甲醇固定細胞15 min，用PBS漂洗3次，每次5 min。隨后在含5%山羊血清、 0.3% TritonTMX-100的PBS中封閉1 h，PBS漂洗3次后加入一抗4℃孵育過夜；PBS清洗3次，加入抗體稀釋緩沖液稀釋的熒光物質(zhì)標記的二抗，室溫下避光孵育2 h；PBS清洗3次，加入DAPI染核后熒光顯微鏡下鏡檢觀察。

1.7 Annexin V-FITC法對貼壁細胞進行原位熒光凋亡檢測根據(jù)參考文獻[11]得知，LY294002在10 mol/L條件下即可對TG細胞內(nèi)的PI3K進行有效抑制且對TG細胞毒性反應(yīng)較小。試驗分別設(shè)空白對照組、PRV組、PRV+LY294002組。將細胞培養(yǎng)至24孔板中，在攻毒前用含LY294002的培養(yǎng)液對TG細胞進行封閉1 h以增強抑制效果，攻毒6 h后，吸去細胞培養(yǎng)液，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，5 μL Annexin V-FITC，混勻后加入10 μL 碘化丙啶染色液，室溫(20～25℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，于倒置熒光顯微鏡下鏡檢觀察。

1.8 流式細胞術(shù)待TG細胞長滿后用PBS多次清洗以洗去未貼壁細胞，隨后進行分組攻毒。將TG細胞用無EDTA的胰蛋白酶消化后收集，用PBS將細胞洗滌2次重懸浮，隨后離心收集細胞，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液、5 μL Annexin V-FITC以及10 μL碘化丙啶染色液，避光孵育后1 h 內(nèi)完成檢測。

1.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達使用含1%蛋白酶抑制劑及1%磷酸化酶抑制劑的RAPI裂解液分別提取TG細胞的總蛋白，測定PI3K、Akt、p-Akt相對表達含量以及Bcl-2、Bax的相對表達含量。經(jīng)BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入5×Loading Buffer以每孔20 μg總蛋白煮沸上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)TBST洗滌3次，每次5 min。經(jīng)封閉后，分別加(PI3K，1∶1 000；Akt,1∶1 000；p-Akt,1∶2 000;Bcl-2,1∶1 000;Bax,1∶1 000,β-actin,1∶3 000)等一抗于4℃孵育過夜;經(jīng)TBST洗滌3次，每次5 min；加入二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBST洗滌后經(jīng)ECL顯色并拍照，用ImageJ軟件進行條帶灰度值分析。

1.10 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件進行分析處理，采用t檢驗或ANOVA單因素方差分析分析其差異性，P<0.05認為組間差異顯著且具有統(tǒng)計學意義；P<0.01認為組間差異極顯著,并利用GraphPad Prism 8.0繪制表格。

2 結(jié)果

2.1 TG細胞原代培養(yǎng)結(jié)果分別取培養(yǎng)后1，3，5，7 d TG細胞進行觀察,結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的小鼠TG細胞在12～24 h時逐漸貼壁，3 d時TG細胞快速生長，待6～7 d時細胞生長停止同時可達到90%以上匯合度(圖1)。神經(jīng)元細胞在培養(yǎng)早期個體較大呈圓形并向四周伸出突觸,培養(yǎng)后期呈透明狀圓形；神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及血旺氏細胞呈紡錘形，與參考文獻中原代TG細胞形態(tài)相符。TG細胞消化后無法進行傳代，僅能原代培養(yǎng)，需現(xiàn)用現(xiàn)做。

A.TG細胞培養(yǎng)至1 d；B.TG細胞培養(yǎng)至3 d；C.TG細胞培養(yǎng)至5 d；D.TG細胞培養(yǎng)至7 d(紅色箭頭為神經(jīng)元細胞；黑色箭頭為神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及血旺氏細胞)

2.2 PRV可感染TG細胞IFA結(jié)果顯示,PRV攻毒TG細胞后可產(chǎn)生綠色熒光，說明PRV可感染TG細胞并在其內(nèi)復制及增殖，且感染后48 h的熒光比24 h更為明顯(圖2)。

A.陰性對照；B.PRV感染24 h；C.PRV感染48 h

2.3 PRV感染TG細胞后不同時間段PI3K、Akt mRNA相對表達變化結(jié)果顯示，1 MOI PRV感染TG細胞早期可顯著上調(diào)細胞內(nèi)PI3K、Akt mRNA表達水平(P<0.01)，PI3K mRNA表達在30 min左右達到峰值，在感染2 h左右降至初始水平(與對照組相比差異不顯著)，隨時間推移抑制PI3K mRNA表達水平；Akt mRNA在感染后15 min即上調(diào)并達到峰值(P<0.01)，隨后迅速下調(diào)并與對照組相比處于抑制狀態(tài)(P<0.01)(圖3)。且PI3K、Akt引物熔解曲線均為單峰，說明引物特異性良好?？傮w來說，PRV感染TG細胞后對PI3K及Akt mRNA的表達呈先促進后抑制的作用，這可能與病毒早期入侵細胞所引起的細胞自身免疫反應(yīng)有關(guān)。

A.PI3K mRNA相對表達結(jié)果；B.Akt mRNA相對表達結(jié)果；C.PI3K熔解曲線；D.Akt熔解曲線。*.P<0.05；**.P<0.01。下同

2.4 PRV感染TG細胞后不同時間段PI3K/Akt相關(guān)蛋白表達變化1 MOI PRV感染TG細胞后在感染早期顯著抑制PI3K的蛋白表達(P<0.01)，但隨著感染時間推移表達量無明顯變化，不同時間段組間差異不顯著(P>0.05)；PRV感染后15 min會顯著上調(diào)Akt的表達(P<0.01)，隨后發(fā)生抑制，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，與兩者mRNA表達變化結(jié)果基本相同，皆為抑制或先促進后抑制；而PRV感染TG細胞的早中期會誘導Akt發(fā)生顯著的磷酸化(P<0.01)，且在15 min時Akt的磷酸化達到峰值(圖4)。Akt的磷酸化是PI3K/Akt信號通路激活的關(guān)鍵步驟，說明PRV感染TG細胞后會誘導PI3K/Akt信號通路激活并發(fā)揮一系列調(diào)控作用。

2.5 IFA觀察PRV感染TG細胞后Akt的磷酸化藍色熒光為DAPI染核，紅色熒光為p-Akt在TG細胞內(nèi)的表達。結(jié)果顯示，PRV感染TG細胞后會誘導Akt產(chǎn)生明顯的磷酸化，同時Akt磷酸化一般發(fā)生在TG細胞的細胞質(zhì)以及細胞核內(nèi)(圖5)。

2.6 Annexin V-FITC法觀察阻斷PI3K/Akt后PRV感染TG細胞的凋亡情況磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)是檢測細胞凋亡的關(guān)鍵分子之一，正常情況下PS一般存在于細胞膜里側(cè)，當細胞出現(xiàn)凋亡時PS會從細胞里側(cè)向外翻并暴露于細胞外表面，同時可與Annexin V特異性結(jié)合，故在熒光下凋亡細胞的細胞膜呈綠色。PI為紅色染核染料。一般來說，細胞膜僅發(fā)出綠色熒光一般為早期凋亡細胞；細胞核發(fā)出紅色熒光為死細胞；綠色以及紅色共染為晚期凋亡細胞。結(jié)果顯示，PRV+LY294002組與空白對照組、PRV組相比，早期凋亡細胞及晚期凋亡細胞數(shù)量均明顯增多(圖6)；說明PRV感染TG細胞后會在一定程度上誘導細胞凋亡，同時PI3K/Akt信號通路在PRV感染TG細胞的凋亡過程中起到抑制細胞凋亡的作用。

2.7 流式細胞術(shù)結(jié)果結(jié)果顯示，與對照組以及PRV感染組相比，PRV+LY294002組凋亡細胞總體數(shù)量明顯增多，與原位熒光染色結(jié)果基本相符，說明PI3K/Akt信號通路在PRV感染TG細胞后抑制凋亡中發(fā)揮了重要作用(圖7)。

A.Western blot結(jié)果;B.PI3K蛋白條帶灰度值分析結(jié)果;C.Akt蛋白條帶灰度值分析結(jié)果;D.p-Akt蛋白條帶灰度值分析結(jié)果

A,D.Akt磷酸化情況；B,E.DAPI染核；C,F.合并

2.8 阻斷PI3K/Akt信號通路對PRV感染TG細胞Bcl-2及Bax蛋白表達的影響Western blot結(jié)果顯示：與空白對照組相比，PRV組以及PRV+LY294002組Bcl-2蛋白表達量降低，同時Bax蛋白表達量提高，且Bcl-2/Bax蛋白表達比值降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值降低說明細胞處于凋亡過程(圖8);說明PRV感染TG細胞會誘導其凋亡，并且PI3K/Akt信號通路于PRV感染TG細胞后在抑制細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，同時PRV是通過經(jīng)典的PI3K/Akt/Bax信號通路調(diào)控細胞凋亡。

A,D,G.PI染細胞核；B,E,H.FITC染細胞質(zhì)；C,F,I.合并

A.mock組；B.PRV組;C.PRV+LY294002組；D.各組細胞凋亡率比較

A.Western blot結(jié)果；B.Bcl-2/Bax灰度值分析結(jié)果

3 討論

目前已有研究表明皰疹病毒感染細胞后會誘導PI3K/Akt信號通路激活并發(fā)揮生物學功能，同時皰疹病毒也會利用PI3K/Akt信號通路優(yōu)化侵入、復制、潛伏感染、重新激活以及對宿主固有免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，且感染不同細胞發(fā)揮的作用可能有所不同[12]。Akt是一類凋亡抑制因子，在抑制細胞凋亡中起到重要作用，Akt磷酸化后可以使Bad等促凋亡相關(guān)因子發(fā)生磷酸化從而抑制凋亡[13]。Bcl家族成員在調(diào)控細胞凋亡的過程中發(fā)揮著重要的作用，而PI3K/Akt可以直接調(diào)控由Bcl-2誘導的細胞凋亡；此外，Akt直接抑制促凋亡蛋白Bax的磷酸化，后者是線粒體通透性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，一般以Bcl-2/Bax表達比值來間接判斷細胞凋亡的過程，Bcl-2/Bax比值越高說明細胞抗凋亡能力越強，反之則易發(fā)生凋亡[14-16]。

TG是PRV潛伏感染的關(guān)鍵部位，本試驗通過原代培養(yǎng)TG細胞，將其作為PRV感染的體外模型，從而探究PRV感染TG細胞誘導PI3K/Akt信號通路的變化規(guī)律。結(jié)果顯示，PRV感染TG細胞無論是PI3K以及Akt蛋白的表達總體來說都處于抑制狀態(tài)且與對照組相比差異顯著，并且PRV感染TG細胞后的早期會誘導Akt發(fā)生磷酸化，這種磷酸化被認為是PI3K/Akt信號通路激活的必要條件。CHANG等[17]為探究PRV感染后誘導PI3K/Akt信號通路的影響，將1 MOI PRV感染PK-15細胞后在不同時間段檢測PI3K、Akt以及p-Akt的蛋白表達，結(jié)果顯示p-Akt的表達在4 h內(nèi)出現(xiàn)明顯降低，而在8 h時Akt的磷酸化基本消失；而PI3K、Akt的總蛋白表達與未攻毒對照組相比無明顯差異，該結(jié)果可能是由于PRV感染的靶細胞不同所導致。研究發(fā)現(xiàn)，一些病原體感染腦內(nèi)會誘導炎癥反應(yīng)從而影響腦神經(jīng)元的代謝及存活，并抑制PI3K/Akt的蛋白表達，同時PRV感染機體后會誘導大量炎癥因子的產(chǎn)生，這可能是PRV感染TG細胞后PI3K/Akt總蛋白表達降低的主要原因，說明PRV存在一種特殊的機制調(diào)控TG細胞內(nèi)的PI3K/Akt信號通路[18-20]。

大量研究顯示PI3K/Akt信號通路對病毒感染誘導的細胞凋亡中發(fā)揮了重要抑制作用，而對于PRV感染TG細胞后是否通過PI3K/Akt信號通路抑制凋亡目前暫不清楚[21]。本試驗利用PI3K特異性抑制劑LY294002阻斷TG細胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路，與空白對照組、PRV感染組相比，PRV感染阻斷PI3K/Akt信號通路的TG細胞后早期凋亡細胞以及晚期凋亡細胞發(fā)出的熒光明顯增多，說明PI3K/Akt信號通路在PRV感染TG細胞后抑制細胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。GEENEN等[22]研究表明PRV的Us3蛋白在PRV感染細胞后抑制細胞凋亡中發(fā)揮了重要作用，與對照組相比Us3缺失株細胞凋亡相關(guān)因子更為明顯，PRV可能利用PI3K/Akt信號通路抑制細胞凋亡以達到病毒在細胞內(nèi)長時間大量復制的結(jié)果。Bcl-2是一種廣泛表達的細胞質(zhì)蛋白，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞存活以及抑制細胞凋亡起到關(guān)鍵作用[23-24]。Bcl-2和Bax是對凋亡具有拮抗作用的細胞質(zhì)蛋白，在細胞凋亡的過程中缺乏Bcl-2會促進神經(jīng)細胞的凋亡，缺乏Bax會抑制神經(jīng)細胞的凋亡并促進了細胞的持續(xù)存活[25]。本試驗結(jié)果顯示，PRV感染阻斷了PI3K/Akt信號通路的TG細胞后會誘導其發(fā)生凋亡，同時在感染的過程中抑制了TG細胞內(nèi)Bcl-2的表達并促進了Bax的表達，說明PRV感染TG細胞后通過PI3K/Akt信號通路抑制TG細胞的凋亡且是通過經(jīng)典的PI3K/Akt/Bcl-2/Bax途徑。

細胞信號通路傳導對于調(diào)控皰疹病毒的潛伏期和再激活的平衡至關(guān)重要，其中PI3K/Akt信號通路在皰疹病毒的潛伏感染起著重要的維持作用。PENG等[26]報道了PI3K/Akt信號通路與兩種γ皰疹病毒潛伏感染的建立之間的關(guān)系，皰疹病毒感染細胞后會通過PI3K抑制劑以劑量依賴的方式促進病毒的復制與增殖，同時于皰疹病毒感染抑制PI3K/Akt通路的細胞中發(fā)現(xiàn)在感染的早期至晚期病毒的相關(guān)基因的表達均有所提高，說明PI3K/Akt信號通路在皰疹病毒的激活中起到了負調(diào)控作用[27]。本試驗通過PI3K特異性抑制劑將TG細胞PI3K/Akt信號通路進行阻斷，用PRV感染TG細胞后發(fā)現(xiàn)抑制了PI3K信號通路的TG細胞會在6 h 后迅速發(fā)生凋亡，這可能與PRV在TG細胞內(nèi)再激活有關(guān)，PRV在阻斷PI3K信號通路的TG細胞內(nèi)激活并快速大量復制增殖，這可能是PRV誘導TG細胞發(fā)生凋亡的主要原因之一。

本研究發(fā)現(xiàn)PRV感染TG細胞后會以Akt磷酸化的形式誘導PI3K/Akt信號通路的激活，但會在感染中后期抑制其mRNA以及蛋白的表達；同時發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路在PRV感染TG細胞后抑制TG細胞的凋亡中發(fā)揮重要作用，該結(jié)果為探究PRV潛伏感染TG細胞過程提供參考，同時通過靶向PI3K/Akt信號通路治療PRV在TG細胞內(nèi)的潛伏感染提供了新的思路。