徐楓雁，張媛媛，劉曉雷，劉明遠，王學林，王 洋，白 雪 (吉林大學 動物醫(yī)學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春130062)

旋毛蟲病(trichinellosis)是由一種常見的寄生蠕蟲，即旋毛蟲(Trichinellaspiralis)寄生于人或多種哺乳動物體內(nèi)引發(fā)的嚴重的食源性人獸共患寄生蟲疾病[1]。宿主通常是因為攝食含有旋毛蟲的未煮熟或生肉引發(fā)感染，該病在人體可以引起不同的癥狀，從全身發(fā)熱、腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、肌肉疼痛到更嚴重的心肌炎和腦炎，嚴重時甚至可致人死亡[2]。寄生于動物體內(nèi)則影響動物自身的生長發(fā)育，已經(jīng)嚴重威脅到人類健康及牲畜養(yǎng)殖業(yè)[3]。近年來，抗旋毛蟲感染的候選疫苗抗原主要集中于混合的旋毛蟲排泄-分泌(excretory secretory,ES)抗原或單個相對分子質(zhì)量的重組功能因子，與滅活的全蟲疫苗或蟲體粗提物以及旋毛蟲排泄分泌產(chǎn)物疫苗相比，單一抗原在感染旋毛蟲的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的免疫保護效果通常相對較低[4]。目前，旋毛蟲疫苗的研究主要包括滅活疫苗、基因重組蛋白疫苗、亞單位疫苗，合成肽疫苗以及DNA疫苗，這些疫苗均可引起有效的保護性免疫應(yīng)答[5]。盡管如此，研制抗旋毛蟲病新型候選疫苗依舊面臨著如旋毛蟲生命周期的復(fù)雜性，階段特異性抗原的多樣性，免疫逃避以及宿主的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)等諸多挑戰(zhàn)。

胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一種可由多種細胞分泌的具有雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)的囊泡，根據(jù)分泌方式可分為微囊泡、外泌體、凋亡小體和遷移體4種[6]。研究發(fā)現(xiàn)，多種寄生蟲來源的EVs對宿主具有調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，提高宿主存活率，增加宿主排蟲能力等免疫保護作用，表明完整的寄生蟲EVs具備開發(fā)疫苗的研究潛力[7-9]。TRELIS等[7]等將棘口吸蟲EVs皮下免疫BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠存活率明顯提高，蟲卵減少60%，蟲體生長發(fā)育遲緩，體內(nèi)IgG和IgM抗體水平升高。SHEARS等[8]使用超速離心法獲取鼠鞭蟲EVs，隨后皮下免疫C57BL/6小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高水平IgG2a/c，減蟲率達60%。KIFLE等[10]對曼氏血吸蟲15,120 kDa的EVs進行蛋白質(zhì)組學分析后發(fā)現(xiàn)其中含有多種可作為曼氏血吸蟲病候選疫苗的蛋白。

迄今為止，旋毛蟲肌幼蟲期胞外囊泡(Trichi-nellaspiralismuscle larvae extracellular vesicles,Ts-ML-EVs)對小鼠是否具有免疫保護效果尚未報道。本試驗首次以Ts-ML-EVs為研究對象，觀察其對感染旋毛蟲前后小鼠成蟲和肌幼蟲減蟲率以及體內(nèi)各抗體水平、細胞因子含量的影響，為旋毛蟲有效候選疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲種和實驗動物旋毛蟲(國際標準蟲種編號：ISS534)由本實驗室保存。6～8周齡健康雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量為16～20 g，購自吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2 主要試劑RPMI1640、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白銀染試劑盒、化學發(fā)光顯影試劑盒均購自中國碧云天生物技術(shù)公司；10 kDa超濾管購自美國Millipore公司；小鼠IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、IgG、IgA、IgE、IgM ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；IgG1、IgG2a ELISA檢測試劑盒購自美國mnimAbs公司；流式熒光PE-CD63和APC-CD81抗體購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5×)購自鼎國生物技術(shù)有限公司；多克隆山羊抗烯醇化酶(Enolase)抗體、單克隆兔抗熱休克蛋白70(Hsp70)抗體均購自英國Abcam公司；HRP標記的驢抗山羊IgG抗體購自美國Jackson ImmunoResearch公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體和HRP標記的兔抗鼠IgG抗體購自美國Cell Signaling公司；IMS1313佐劑感謝法國賽比克公司饋贈。

1.3 旋毛蟲肌幼蟲期EVs的分離與鑒定取感染旋毛蟲35 d以上的Wistar大鼠處死，使用集樣消化法獲得旋毛蟲肌幼蟲(Ts-ML)。將Ts-ML放入事先加好2%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)16 h后取出培養(yǎng)上清，通過差速離心法去除培養(yǎng)上清中的蟲體及其他雜質(zhì)，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，使用10 kDa超濾管超濾濃縮培養(yǎng)上清并不斷用PBS置換至無色上清獲得Ts-ML-ES。培養(yǎng)基上清經(jīng)10 kDa超濾管濃縮后利用超速離心法獲得Ts-ML-EVs，最后Ts-ML-EVs經(jīng)透射電子顯微鏡觀察、納米顆粒追蹤分析、流式細胞術(shù)標記EVs表面特異蛋白CD63和CD81和Westren blot分析進行鑒定。

1.4 旋毛蟲肌幼蟲期EVs對小鼠的免疫程序及攻蟲試驗將32只小鼠隨機平均分為4組，具體免疫程序參考文獻[11]。將30 μgTs-ML-ES和50 μgTs-ML-EVs分別與佐劑1∶1等體積混勻后皮下多點注入小鼠體內(nèi)并輕柔注射點防止疫苗漏出導致免疫失敗，PBS對照組和佐劑對照組注射等體積的PBS溶液和PBS+佐劑混合物。三免后2周每只小鼠灌胃肌幼蟲300條，灌胃后6 d每組隨機取2只小鼠處死，獲得各組旋毛蟲成蟲(Ad6)并逐個計數(shù)，比較免疫組與對照組Ad6的數(shù)量差異。攻蟲后35 d，所有小鼠全部處死，計算各免疫組的肌幼蟲減蟲率。

1.5 樣品的采集和預(yù)處理小鼠每次免疫前、末次免疫后2周、攻蟲前、攻蟲后35 d分別眼眶采血。采集的血液37℃放置1 h后再經(jīng)1 500 r/min離心15 min獲得上層透明血清，分裝后放置-80℃冰箱保存，用于后續(xù)Western blot分析和ELISA檢測試驗。

1.6 Western blot分析將Ts-ML-EVs和Ts-ML-ES分別定量20 μg，與5×蛋白上樣緩沖液均勻混合后電浴10 min，冷卻至室溫后上樣到12% SDS-PAGE凝膠，上層膠電壓70 V、30 min，下層膠電壓120 V、2 h。結(jié)束后切下目的條帶，濕轉(zhuǎn)2 h后放入5%脫脂牛奶封閉液中室溫搖床封閉2 h。封閉結(jié)束后將PVDF膜分別放入加好三免的Ts-ML-EVs小鼠血清(1∶200)，多克隆山羊抗Enolase(1∶200)和單克隆兔抗Hsp70(1∶1 000)的封閉液中，4℃搖床孵育過夜。次日使用TBST洗6遍，每次5 min，然后分別將HRP標記的兔抗鼠IgG(1∶3 000)，驢抗山羊IgG(1∶50 000)和山羊抗兔IgG(1∶2 000)的二抗加入封閉液中，室溫搖床孵育2 h，結(jié)束后用TBST洗滌6次，每次5 min，最后應(yīng)用UVP Chemstudio多功能化學發(fā)光成像系統(tǒng)拍攝結(jié)果并保存。

1.7 免疫小鼠血清抗體和細胞因子檢測將收集到的不同天數(shù)的血清分組標記好后使用ELISA試劑盒檢測抗體IgG、IgA、IgE、IgM、IgG1、IgG2a以及細胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量，每組設(shè)3個重復(fù)。酶標儀檢測吸光度(D450值)，并按照說明書繪制標準曲線，計算細胞因子濃度。

2 結(jié)果

2.1 旋毛蟲肌幼蟲期EVs的分離、純化與鑒定透射電子顯微鏡觀察到Ts-ML-EVs呈典型雙層磷脂膜囊泡樣結(jié)構(gòu)(圖1)；納米顆粒追蹤分析結(jié)果顯示Ts-ML-EVs直徑為100～180 nm，峰值為126 nm(圖2)，符合寄生蟲EVs形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。通過流式細胞術(shù)檢測到EVs表面標志物CD63和CD81(圖3)；Western blot結(jié)果表明，Ts-ML-EVs中含有EVs標志蛋白Enolase和Hsp70(圖4)。

2.2 旋毛蟲肌幼蟲期EVs的SDS-PAGE和Western blot分析SDS-PAGE分析顯示Ts-ML-EVs、Ts-ML-ES、Ts-ML-EVs上清的蛋白組分成分均一、穩(wěn)定無降解，相對分子質(zhì)量分布于10～190 kDa，其中大部分蛋白條帶是各組分所共有的(圖5)。但是，與Ts-ML-EVs相比，其他組分存在幾條特異性和差異性表達蛋白條帶。Ts-ML-ES相對分子質(zhì)量為40 kDa 的蛋白條帶有所增加，Ts-ML-EVs相對分子質(zhì)量在45～75 kDa之間的蛋白含量更高。經(jīng)Western blot分析，純化后的Ts-ML-EVs可被接種3次Ts-ML-EVs后的小鼠血清特異性識別，而與健康小鼠血清呈陰性反應(yīng)(圖6)，證明Ts-ML-EVs有較好的反應(yīng)原性。

圖1 Ts-ML-EVs在透射電子顯微鏡下的形態(tài)

圖2 納米顆粒追蹤分析Ts-ML-EVs的粒徑大小

圖3 流式細胞術(shù)檢測Ts-ML-EVs表面抗體標志物CD63和CD81

1.蟲體蛋白；2.Ts-ML-EVs

2.3 旋毛蟲肌幼蟲期EVs對小鼠體內(nèi)各特異性抗體水平影響分析將各組抗原免疫小鼠后，使用ELISA試劑盒檢測免疫后各時間段小鼠體內(nèi)各特異性抗體水平變化趨勢。結(jié)果表明，與PBS組和佐劑對照組比較，Ts-ML-EVs組在首免和二免后特異

M.預(yù)染蛋白Marker；1.Ts-ML-EVs；2.Ts-ML-ES；3.Ts-ML-EVs上清；4.Ts蟲體蛋白

M.蛋白Marker；1，3 Ts-ML-ES； 2，4.Ts-ML-EVs； 1，2.健康小鼠血清； 3，4.三免Ts-ML-EVs后的小鼠血清

性IgG水平緩慢升高，三免后抗體水平迅速增加(圖7A)，差異極顯著(P<0.000 1)，表明Ts-ML-EVs能誘導機體產(chǎn)生一定的體液免疫應(yīng)答。首免后，試驗組IgG1抗體水平迅速上升，直至三免后兩抗體水平達到最高(圖7C)。一免后，Ts-ML-EVs組IgG2a抗體水平緩慢升高，二免后抗體水平迅速上升，與對照組差異極顯著(P<0.000 1)(圖7D)，此外IgG1水平高于IgG2a，且差異顯著(P<0.05)。說明Ts-ML-EVs能誘導以Th2為主的Th1/Th2混合免疫應(yīng)答。首免后IgM抗體迅速增加，二免后緩慢增加，達到最高值，三免后抗體水平呈下降趨勢(圖7B)，表明Ts-ML-EVs能誘導機體產(chǎn)生高水平的IgM抗體。Ts-ML-EVs組經(jīng)一免、二免后IgA抗體在緩慢上升，三免后顯著升高(P<0.01)(圖7E)，表明Ts-ML-EVs能誘導機體產(chǎn)生一定水平的IgA抗體。Ts-ML-EVs組一免、二免后IgE抗體迅速增加，三免后Ts-ML-EVs組IgE抗體水平緩慢增加達到最高值(圖7F)，表明Ts-ML-EVs能誘導機體產(chǎn)生高水平的IgE抗體。

A.各組小鼠血清中IgG抗體含量變化;B.各組小鼠血清中IgM抗體含量變化;C.各組小鼠血清中IgG1抗體含量變化;D.各組小鼠血清中IgG2a抗體含量變化;E.各組小鼠血清中IgA抗體含量變化;F.各組小鼠血清中IgE抗體含量變化。*示P<0.05；**示P<0.01；***示P<0.001；****示P<0.000 1。下同

2.4 旋毛蟲肌幼蟲期EVs對小鼠體內(nèi)細胞因子含量影響分析將各組抗原免疫小鼠后，使用ELISA試劑盒檢測免疫前后各時間段小鼠體內(nèi)Th1和Th2型細胞因子的變化趨勢。試驗結(jié)果顯示，與PBS組和佐劑對照組相比，一免后其他2組IL-4和IL-10的水平均極顯著升高(P<0.01)，并隨著免疫次數(shù)增加不斷上升，三免2周后達到最高(圖8A，B)。而IL-12和IFN-γ的水平隨著免疫次數(shù)增加略有升高(圖8C，D)，與Th2型(IL-4、IL-10)細胞因子差異顯著(P<0.05)，2組之間無明顯差異。PBS和佐劑對照組4種細胞因子均無顯著變化。結(jié)果表明，Ts-ML-EVs能誘導機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答，且與體液免疫應(yīng)答結(jié)果一致。經(jīng)過計算后結(jié)果顯示，Ts-ML-EVs的成蟲減蟲率為23.4%，肌幼蟲減蟲率為43.7%(圖9)。

A.各組小鼠血清中細胞因子IL-4含量變化；B.各組小鼠血清中IL-10含量變化;C.各組小鼠血清中IL-12含量變化;D.各組小鼠血清中IFN-γ含量變化

圖9 各試驗組的成蟲和肌幼蟲減蟲率

3 討論

EVs是直徑大小集中在50～250 nm、具有磷脂雙分子層橢圓形結(jié)構(gòu)的囊泡[12]。EVs的鑒定方法通常為透射電鏡觀察、納米顆粒追蹤分析和Western blot等，隨著科學技術(shù)發(fā)展，近年來流式細胞術(shù)也越來越多地應(yīng)用到EVs表面標志蛋白鑒定中，因此運用上述方法對收集到的囊泡進行鑒定。結(jié)果證明本試驗獲得的囊泡呈典型雙層囊泡結(jié)構(gòu)，直徑為100～180 nm，峰值為126 nm，具有EVs表面標志物CD63和CD81，內(nèi)含EVs標志蛋白Enolase和Hsp70，符合寄生蟲EVs表征，可以用于進一步的免疫保護性試驗。

目前已鑒定到寄生蟲EVs中包含部分免疫調(diào)節(jié)分子或與已知免疫調(diào)節(jié)分子相似的蛋白，除此之外EVs還含有mRNA、miRNA、脂質(zhì)等物質(zhì)，在蟲體侵襲及與宿主的相互作用過程中發(fā)揮重要作用[13-14]。本試驗Western blot結(jié)果顯示，Ts-ML-EVs可識別抗Ts-ML-EVs小鼠免疫血清，具有免疫反應(yīng)原性，與Ts-ML ES相比多出40～45 kDa條帶，表明Ts-ML-EVs可能參與宿主抗旋毛蟲感染免疫反應(yīng)。為了探究Ts-ML-EVs對小鼠免疫保護效果，本試驗將Ts-ML-EVs與IMS1313佐劑等體積均勻混合作為疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過三免后，Ts-ML-EVs的成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為23.4%和43.7%。Ts-ML-EVs在Ts-ML-ES中占比極低，但具有很好的免疫原性，表明Ts-ML-EVs起到一定的抗寄生蟲作用，是一種很好的抗旋毛蟲免疫候選抗原，有利于更加快速篩選免疫調(diào)節(jié)分子，研制新型候選疫苗。

COAKLEY等[15]利用多形螺旋線蟲EVs免疫C57BL/6小鼠，結(jié)果減蟲率為82%，且小鼠體內(nèi)存在高滴度的IgM、IgG1和IgA抗體。本試驗結(jié)果表明，與PBS組和佐劑對照組相比，首次免疫開始后，Ts-ML-EVs免疫組小鼠體內(nèi)IgG和IgM水平含量即顯著上升，并且隨著加強免疫的次數(shù)持續(xù)增加，其中以IgM變化最為明顯，首免2周后即可在小鼠體內(nèi)檢測到高滴度抗體，但與其他抗體不同的是，二免2周后抗體水平達到最高值，三免后則開始緩慢下降，IgA和IgE含量也同樣升高，但沒有其他幾種抗體變化差異明顯。研究發(fā)現(xiàn)IgM是寄生蟲感染后獲得性免疫最先產(chǎn)生的抗體，激活經(jīng)典的補體級聯(lián)反應(yīng)的能力是IgG的1 000倍，具有加強和促進體液免疫應(yīng)答的能力，在抵抗蠕蟲感染中發(fā)揮重要作用，推測IgM可能通過促進IgG的應(yīng)答間接參與了抗旋毛蟲的保護性免疫應(yīng)答，因此當IgG水平達到一定高度時，IgM則開始逐漸下降[11,16-17]?？赡苁怯捎赥s-ML-EVs可以誘導小鼠產(chǎn)生各種高滴度抗體和細胞因子，因此可以通過影響旋毛蟲生長發(fā)育過程，發(fā)揮抵抗蟲體侵襲作用。

據(jù)報道，Th1型細胞因子具有清除胞內(nèi)病原體的功能，而Th2型細胞因子可以聚集和激活嗜酸性粒細胞和肥大細胞，從而抵抗寄生蟲感染[18]。本試驗細胞因子水平變化顯示Th1(IFN-γ、IL-12)和Th2(IL-4、IL-10)型免疫反應(yīng)均增強，其中代表Th2型免疫反應(yīng)的IL-4和IL-10細胞因子變化較明顯，而IL-4在抗旋毛蟲感染中發(fā)揮重要作用。研究表明，IgG1反映了Th2型免疫反應(yīng)，IgG2a則反映Th1型免疫反應(yīng)，同時發(fā)現(xiàn)IgG1和IgG2a含量隨著免疫次數(shù)增加不斷上升且IgG1水平高于IgG2a，差異顯著(P<0.05)。這2種抗體水平變化與細胞因子含量相符合。

綜上所述，本研究首次將Ts-ML-EVs作為疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)抗體增加，細胞因子水平變化顯示Ts-ML-EVs可引起Th1/Th2型混合免疫反應(yīng)，且以Th2型免疫反應(yīng)為主，成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為23.4%和43.7%。本試驗為篩選有效旋毛蟲疫苗抗原及進一步開展相關(guān)研究提供理論依據(jù)。