孟碟方，趙怡凡，方俊博，馬增友，武曼曼，秦 歌，彭 輝 (福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/蜂學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡[1],細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡在生殖器官中更明顯，可以在睪丸內(nèi)的多個部位發(fā)生[2-4]。在雄性睪丸發(fā)育與精子發(fā)生過程中，細(xì)胞凋亡在控制生殖細(xì)胞數(shù)量和清除缺陷生殖細(xì)胞方面起著重要作用[5-6]。在增殖過程中染色體異常的精原細(xì)胞會在凋亡后被清除，在多種家畜中也已經(jīng)報道過自發(fā)性精原細(xì)胞凋亡的情況。生殖細(xì)胞的成熟與支持細(xì)胞密切相關(guān)，一般支持細(xì)胞的凋亡率較低，早期過量產(chǎn)生的精原細(xì)胞最終會選擇性凋亡以平衡生殖細(xì)胞/支持細(xì)胞的比率[7-8]。在成年大鼠中A2-A4型精母細(xì)胞會發(fā)生凋亡[8-9]，從而保持恒定數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂期。

研究表明，賴氨酸?；饔冒ㄙ嚢彼嵋阴；⒈；?、丁?；㈢牾；⒈；⑽於；?、巴豆?；?crotonylation,Kcr)和β-羥基異丁?；?。其中賴氨酸Kcr是一種進(jìn)化上保守的組蛋白標(biāo)記，最初在組蛋白上發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步研究表明大量非組蛋白也可以發(fā)生Kcr修飾。Kcr作為一種新型的酰化修飾，是由?；D(zhuǎn)移酶以巴豆酰輔酶A為底物，將巴豆?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到賴氨酸殘基上而產(chǎn)生的一種新型修飾。該修飾類型在人類體細(xì)胞和小鼠雄性生殖細(xì)胞基因組中首次發(fā)現(xiàn)，并在雄性生殖細(xì)胞中富集[10]，參與啟動雄性單倍體細(xì)胞基因的表達(dá)[11]。Kcr修飾多發(fā)生在參與RNA加工、核酸代謝、染色體組織和基因表達(dá)的核蛋白上，多種蛋白功能和細(xì)胞過程受Kcr的調(diào)控[12]。

本試驗研究不同發(fā)育階段豬睪丸組織的形態(tài)學(xué)變化以及精子發(fā)生過程中細(xì)胞凋亡情況和Kcr修飾水平。該研究結(jié)果為揭示豬精子發(fā)生過程中的形態(tài)變化及調(diào)控機制提供參考，也為深入研究哺乳動物精子發(fā)生過程中的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2，4，6，8月齡杜洛克公豬睪丸取自福建某種豬場。

1.2 主要試劑DAPI染色液、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western blot相關(guān)試劑和免疫熒光染色試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司；免疫印跡二抗Odyssey?Demo Kit Ⅱ購自LI-COR公司；Anti-crotonyllysine rabbit pAb抗體、H2BK34cr pAb和H2BK20cr pAb購自杭州景杰生物科技有限公司。

1.3 睪丸組織切片制備豬睪丸組織在PBS中清洗2次，加入4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，1 d后取出用蒸餾水沖洗12 h。睪丸組織依次放入由低到高濃度的酒精中脫水，經(jīng)過二甲苯透明和石蠟包埋，將組織塊固定在切片機上切出厚約5 μm的切片，展片和撈片后放入60℃左右恒溫烘干箱烘干備用。

1.4 HE染色用二甲苯除去睪丸切片中殘存的石蠟，再將切片放入從高到低濃度的酒精中，之后置于蒸餾水中2 min。取出切片在蘇木精染液中染色3～8 min，用蒸餾水沖洗5 min。再將切片置于1%鹽酸酒精中分化數(shù)秒，蒸餾水沖洗后再用0.6%氨水返藍(lán)，蒸餾水沖洗，在伊紅染色液中染色2～3 min。染色后的切片經(jīng)無水乙醇脫水、二甲苯透明、滴上樹膠、蓋上蓋玻片封片。

1.5 TUNEL染色切片水化后滴加不含DNase的20 mg/L蛋白酶K，室溫處理15～30 min，用PBS沖洗切片3～5次。配制TUNEL檢測液，標(biāo)記為TdT酶∶熒光標(biāo)記液∶TUNEL檢測液=1∶9∶10。每張切片滴加50 μL TUNEL檢測液覆蓋組織樣品，室溫避光孵育1 h。PBS沖洗切片3次，滴加DAPI染色液室溫避光染色10 min。最后將抗熒光淬滅封片液滴加在切片上進(jìn)行封片，在熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 睪丸蛋白樣品的制備剪取100 mg左右的睪丸組織放入離心管中，加入1 mL組織裂解液(IP)和蛋白酶抑制劑(PMSF)混合液(IP∶PMSF=100∶1)以及鋼珠，將離心管置于預(yù)冷過的高通量組織研磨儀中，70 HZ，60 s進(jìn)行研磨。研磨后的混合液在4℃離心機13 000×g，離心10 min。吸取上清液加入Loading bufferr充分混合，100℃水浴鍋中孵育10 min，-20℃保存。

1.7 免疫印跡制備12%SDS-PAGE凝膠，吸取等量的蛋白樣品加入凝膠電泳泳道，電壓設(shè)置為上層膠80 V/30 min，下層膠120 V/1 h進(jìn)行電泳。根據(jù)目的蛋白的大小將凝膠裁下，用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。將NC膜正面向上放入含有5%脫脂奶粉的TBS/0.1% Tween 20(TBST)溶液中，室溫封閉3 h。封閉結(jié)束后，用TBST溶液按相應(yīng)比例稀釋目的蛋白抗體(anti-crotonyllysine rabbit pAb按1∶1 000稀釋；H2BK34cr pAb和H2BK20cr pAb按1∶2 000稀釋)，NC膜正面向上浸沒在一抗稀釋液中4℃過夜孵育。TBST洗NC膜3次，每次5 min。再用TBST溶液按1∶20 000比例稀釋IRDye?近紅外熒光二抗，室溫避光孵育2 h。TBST室溫避光洗3次，每次5 min。Actin作為內(nèi)參，用雙色紅外激光成像系統(tǒng)Odyssey CLx進(jìn)行曝光拍照。

1.8 免疫熒光睪丸組織切片脫蠟后，通過不同濃度乙醇對切片進(jìn)行水化處理。免疫染色洗滌液沖洗切片3次，每次5 min，使用含0.2%Triton X-100的PBS液體室溫孵育20 min通透打孔。之后用免疫染色洗滌液沖洗切片1次，在組織上滴加專用封閉液室溫封閉4 h。用一抗稀釋液按1∶500稀釋Kcr泛抗體，在切片組織上滴加一抗4℃過夜孵育。用免疫熒光洗滌液洗3次，每次5 min。熒光二抗按1∶500稀釋，室溫避光孵育2 h。用免疫熒光洗滌液沖洗切片3次，每次5 min。DAPI染色液染核，染色時間5 min。用免疫熒光洗滌液沖洗切片3次，每次5 min，最后在切片上滴加熒光抗淬滅劑后進(jìn)行封片，通過LEICA熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育階段豬睪丸組織的形態(tài)學(xué)觀察豬睪丸組織切片HE染色顯示，隨著月齡的增加，精細(xì)管由不規(guī)則形狀逐漸發(fā)育成近圓形(圖1A)，管腔直徑顯著增大(圖1B)；管腔內(nèi)支持細(xì)胞逐漸發(fā)育、體積增大并呈不規(guī)則椎體。被支持細(xì)胞包裹的生精細(xì)胞從4月齡開始分裂，排列逐漸有序表示精子發(fā)生正常進(jìn)行(圖1A)。

A.不同發(fā)育時期豬睪丸切片HE染色(比例50 μm)；B.不同發(fā)育時期豬睪丸精細(xì)管管腔直徑

2.2 不同發(fā)育階段豬睪丸內(nèi)細(xì)胞凋亡變化為了研究睪丸細(xì)胞凋亡變化情況，對睪丸組織進(jìn)行凋亡染色。如圖2A所示，不同發(fā)育階段豬睪丸細(xì)胞均有少量的TUNEL陽性生精細(xì)胞。就凋亡指數(shù)而言，4，6月齡組的凋亡指數(shù)顯著高于2，8月齡組(P<0.05)。

2.3 不同發(fā)育階段豬睪丸蛋白Kcr修飾水平為了檢測豬睪丸蛋白Kcr修飾水平，提取不同發(fā)育階段豬睪丸蛋白進(jìn)行免疫印跡分析。如圖3A所示，利用Kcr泛抗體檢測豬睪丸蛋白Kcr修飾水平時，每個泳道都檢測出多個條帶，說明每個發(fā)育階段的睪丸中都有較多的蛋白質(zhì)發(fā)生Kcr修飾，其中大部分條帶隨著月齡增加而逐漸減弱。利用H2BK20cr和H2BK34cr位點特異性抗體分別檢測H2BK20和H2BK34位點的Kcr水平，如圖3B所示，H2BK20和H2BK34位點的Kcr修飾水平隨著月齡增加而逐漸降低。

2.4 不同發(fā)育階段豬睪丸Kcr蛋白定位將不同發(fā)育階段豬睪丸制成組織切片，通過免疫熒光試驗進(jìn)一步研究Kcr蛋白在豬睪丸組織中的定位。由圖4可知，在不同月齡的豬睪丸中，睪丸間質(zhì)細(xì)胞、足細(xì)胞和生精細(xì)胞內(nèi)都存在Kcr修飾，隨著月齡的增加，整體修飾水平有下降的趨勢。

3 討論

豬睪丸組織切片HE染色表明，從2～6月齡豬睪丸精細(xì)管管腔內(nèi)支持細(xì)胞逐漸發(fā)育、體積增大并呈不規(guī)則椎體。被支持細(xì)胞包裹的生精細(xì)胞從4月齡開始分裂產(chǎn)生精細(xì)胞。在嚙齒類動物中，支持細(xì)胞數(shù)量在睪丸分化后持續(xù)增加，直到大鼠出生后15 d 和小鼠青春期早期，此后數(shù)量保持不變[13-16]。在家畜上，睪丸支持細(xì)胞的增殖發(fā)生在公羊出生后的6～12周[17-19]，公豬出生后的17周前后[20]，公牛出生后的20周左右[21]。在精母細(xì)胞進(jìn)入第1次減數(shù)分裂前，支持細(xì)胞之間通過特殊連接形成血液-睪丸屏障[22-24]，該屏障的形成是精子發(fā)生的關(guān)鍵，任何延遲都會阻止減數(shù)分裂的開始[24-25]。

A.藍(lán)色熒光為細(xì)胞核染色;綠色熒光為凋亡細(xì)胞染色(比例尺50 μm)；B.凋亡指數(shù)的統(tǒng)計

A.Kcr蛋白在不同發(fā)育階段豬睪丸細(xì)胞中的表達(dá);B.H2BK20和H2BK34在豬睪丸中的Kcr修飾水平。M.蛋白Marker;1.2月齡；2.4月齡；3.6月齡；4.8月齡

圖4 Kcr蛋白在不同發(fā)育階段豬睪丸中的定位(比例尺50 μm)

在精子發(fā)生過程中，生殖細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂、減數(shù)分裂和細(xì)胞變形產(chǎn)生成熟的精子。在形成精子的過程中，細(xì)胞核和染色質(zhì)會發(fā)生變化。組蛋白由特異性變體到過渡蛋白，最后被魚精蛋白所取代，導(dǎo)致精子染色質(zhì)的高度濃縮狀態(tài)[26]。精子發(fā)生的正常完成和成熟精子的最終數(shù)量取決于發(fā)育中的生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞的相互作用。豬睪丸組織的TUNEL染色表明4，6月齡這2個月齡的凋亡細(xì)胞數(shù)量相較于2，8月齡時顯著增加，說明從4月齡開始生精細(xì)胞開始減數(shù)分裂，支持細(xì)胞已發(fā)育成熟，為維持生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞比例的平衡，部分精原細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。

Kcr是最近發(fā)現(xiàn)的蛋白新型修飾類型，真核細(xì)胞中的組蛋白和非組蛋白都能發(fā)生Kcr修飾。HAWKINS等[27]鑒定了人類組蛋白上130個修飾位點，包括63個已知和67個新的組蛋白標(biāo)記，其中有28個Kcr位點，首次發(fā)現(xiàn)組蛋白Kcr修飾可以作為活性基因轉(zhuǎn)錄起始位點的標(biāo)記和被預(yù)測為增強子的區(qū)域。在減數(shù)分裂后的雄性生殖細(xì)胞中，組蛋白Kcr的增加促進(jìn)了X連鎖單倍體細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，作為減數(shù)分裂后活性性染色體相關(guān)基因的特異性標(biāo)記[10]。為進(jìn)一步研究豬睪丸蛋白中的Kcr修飾情況和Kcr蛋白的定位，本試驗使用抗Kcr的泛抗體進(jìn)行免疫印跡和免疫熒光檢測，免疫印跡結(jié)果顯示大部分蛋白條帶隨著豬月齡的增加而減弱，說明整體Kcr修飾水平有下降的趨勢，造成該結(jié)果的一個原因可能為在精子發(fā)生過程中組蛋白逐漸被魚精蛋白取代所致。BAKER等[13]使用抗Kcr的泛抗體在核心組蛋白H2B檢測到Kcr信號，在核小體外表面發(fā)現(xiàn)了新的PTM位點，包括H2BK116的單甲基賴氨酸和甲酰賴氨酸，推測這些位點極有可能對轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控產(chǎn)生重要影響。在哺乳動物中，已經(jīng)確定了7個組蛋白H3 Kcr修飾位點(H3K4、H3K9、H3K18、H3K23、H3K27、H3K56和H3K-122)和3個組蛋白H4 Kcr修飾位點(H4K5、H4K8和H4K12)[10,28]。在植物中，用Kcr泛抗體和H3K14cr特異性抗體進(jìn)行水稻幼苗組蛋白Kcr的全基因組檢測，鑒定了4個組蛋白Kcr修飾位點，分別為H3K14、H3K79、H4K31和H4K79[29]。本研究挑選組蛋白H2BK20和H2BK34這2個位點進(jìn)行Kcr修飾水平分析，結(jié)果顯示隨著月齡的增加，豬睪丸組織Kcr修飾水平逐漸降低，提示精子發(fā)生過程中組蛋白逐漸被魚精蛋白所取代，組蛋白上Kcr修飾逐漸減少。

本研究利用免疫熒光技術(shù)檢測Kcr蛋白在豬睪丸組織中的定位，結(jié)果顯示在睪丸細(xì)胞中均能檢測到Kcr蛋白定位，提示Kcr蛋白在多種類型細(xì)胞中均存在且發(fā)揮一定的作用。在同一種類型細(xì)胞中，Kcr蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中也均有定位，說明除了組蛋白能發(fā)生Kcr以外，大量的非組蛋白也能發(fā)生Kcr。隨著豬月齡的增加，切片的免疫熒光強度減弱趨勢明顯，該觀察結(jié)果與免疫印跡的結(jié)果一致。研究表明蛋白的Kcr修飾參與哺乳動物精子的發(fā)生，但具體的調(diào)控機制還不清楚，本研究后期將利用多種方法進(jìn)一步揭示Kcr蛋白在豬睪丸發(fā)育過程中的功能。