章 凡,常曉冉,王浴光,楊茗葳,米日古麗買吐送，董 坤,胡俊英,王新平,2* (.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 30062；2.吉林大學(xué) 人獸共患病研究所 教育部人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 30062)

腸道病毒(enterovirus,EV)為小核糖核酸病毒科腸道病毒屬成員[1-2]，其所引起的感染嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。該病毒為無(wú)囊膜單股正鏈RNA病毒，病毒粒子大小為20～30 nm,具有典型的二十面體結(jié)構(gòu)[3]。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)的最新分類，腸道病毒屬分為12個(gè)腸道病毒種(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L)與3個(gè)鼻病毒種(A、B、C)[4],其中E種(EV-E)和F種(EV-F)主要感染牛，G種主要感染豬， H、J種主要感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物，I種主要感染單峰駱駝，K、L為新的腸道病毒種。

牛腸道病毒(bovine enterovirus,BEV)感染于1959年首次由MOLL等[5]報(bào)道，之后許多國(guó)家也先后報(bào)道有本病的發(fā)生與流行[6-11]。李英利等[12]于2011年報(bào)道從內(nèi)蒙古腹瀉犢牛體內(nèi)分離到我國(guó)第1株EV-F，確定我國(guó)牛群存在EV-F感染。本實(shí)驗(yàn)室于2012年從吉林省長(zhǎng)春市某牛場(chǎng)發(fā)病牛群中分離獲得首株EV-E HY12毒株[1-2]，進(jìn)而確定國(guó)內(nèi)牛群存在EV-E感染。由于EV-E和EV-F屬于兩個(gè)不同的腸道病毒種,兩者間的核苷酸差異很大，屬于不同的血清型/基因型,因而常規(guī)方法難以將其區(qū)別[12]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)許多地區(qū)牛群存在EV-E或EV-F腸道病毒感染，且某些牛群存在不同腸道病毒種的混合感染[13-15]。雖然有關(guān)檢測(cè)EV-E或EV-F的研究逐年增加，但鑒別EV-E和EV-F感染的方法尚未見(jiàn)有報(bào)道。因此,迫切需要建立一種快速鑒別EV-E和EV-F的方法。本研究根據(jù)GenBank收錄的EV-E和EV-F的全基因組序列比對(duì)分析結(jié)果，合成了2對(duì)特異性引物，建立了鑒別EV-E和EV-F的復(fù)合PCR方法，并初步用于臨床樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 病毒株和臨床樣品牛細(xì)小病毒、牛病毒性腹瀉病毒、EV-E HY12毒株、EV-F SD-S67毒株等病毒由本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。待檢牛糞便樣本采自長(zhǎng)春地區(qū)牛場(chǎng)，共計(jì)32份,樣品按常規(guī)方法處理、保存。

1.2 主要試劑和儀器TRIZol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司;DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司； ETC811 基因擴(kuò)增儀為北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品；EPS300 電泳儀、4600SF紫外成像儀為上海天能科技有限公司產(chǎn)品； NanoDrop2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Forma公司；D1524R高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank收錄的EV-E(D00214、DQ092792、DQ092786、KU17-2420、JQ690748、KF748290)和EV-F(DQ0-92770、DQ092795、DQ092794、AY462106、LC038-188)的基因組序列，以Meg Align(DNAStar)軟件進(jìn)行序列分析，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)、合成2對(duì)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增EV-E和EV-F的基因片段大小分別為604，288 bp。引物由生工生物科技有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

1.4 EV-E和EV-F單一PCR方法的建立應(yīng)用提取的EV-E和EV-F感染細(xì)胞的RNA,合成cDNA，并以合成的cDNA為模板，進(jìn)行病毒基因片段的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，即于反應(yīng)體系中加入2×rTaq酶12.5 μL，模板0.5 μL，上、下游引物至終濃度為10 μmol/L，最后以ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,51℃ 30 s,72℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃ 10 min。同時(shí)以未加模板作為陰性對(duì)照。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行EV-E和EV-F單一PCR的特異性及敏感性試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。

應(yīng)用DNA凝膠回收試劑盒，純化和回收目的產(chǎn)物，并將其克隆到pMD18-T載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMD18-EV-E和pMD18-EV-F。鑒定出的陽(yáng)性重組質(zhì)粒序列測(cè)定后，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度,并計(jì)算其拷貝數(shù)，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 復(fù)合PCR引物信息

1.5 復(fù)合PCR檢測(cè)方法的建立條件優(yōu)化以單一PCR擴(kuò)增的條件為參考,利用梯度PCR程序?qū)?fù)合PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。以不同的退火溫度(50～60℃)和反應(yīng)體系(10～30 μL)等條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6 特異性試驗(yàn)應(yīng)用優(yōu)化后的復(fù)合PCR方法，對(duì)混合感染EV-E和EV-F病料的cDNA及實(shí)驗(yàn)室保存的陽(yáng)性牛細(xì)小病毒、牛病毒性腹瀉病毒的核酸進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 敏感性試驗(yàn)以不同稀釋濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,確定出PCR擴(kuò)增特異性片段所需要的最低拷貝數(shù)，即PCR的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)以混合的EV-E和EV-F的cDNA為模板,應(yīng)用建立的PCR方法重復(fù)檢測(cè)3次,確定該方法的可靠性和重復(fù)性。

1.9 應(yīng)用性試驗(yàn)應(yīng)用建立的復(fù)合PCR方法，檢測(cè)吉林省長(zhǎng)春地區(qū)疑似BEV感染的32份臨床樣本,并與ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算兩者符合率。

2 結(jié)果

2.1 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果利用P1/P2和P3/P4引物分別對(duì)EV-E和EV-F陽(yáng)性DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后可檢測(cè)到 604 bp(EV-E)和 288 bp(EV-F) 大小片段(圖1,2)。特異性結(jié)果均僅能擴(kuò)增出EV-E或EV-F。敏感性結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的EV-E和EV-F最低拷貝數(shù)為 3.67×102，5.21×103拷貝/μL。序列測(cè)定結(jié)果顯示，大小為 604，288 bp 的片段分別為EV-E和EV-F。

A.EV-E單一PCR擴(kuò)增結(jié)果(1.陰性對(duì)照;2.EV-E 擴(kuò)增產(chǎn)物);B.EV-E特異性試驗(yàn)(1.陰性對(duì)照;2.EV-E;3.BVDV);C.EV-E敏感性試驗(yàn)(1～10.3.67×109～0拷貝;11.陰性對(duì)照); M.DL2000 DNA Marker

A.EV-F單一PCR擴(kuò)增結(jié)果(1.陰性對(duì)照;2.EV-F擴(kuò)增產(chǎn)物)；B.EV-F特異性試驗(yàn)(1.陰性對(duì)照;2.EV-F;3.BVDV);C.EV-F敏感性試驗(yàn)(1～10.3.67×109～0拷貝;11.陰性對(duì)照);M.DL2000 DNA Marker

2.2 復(fù)合PCR的擴(kuò)增及條件優(yōu)化結(jié)果優(yōu)化確定出的最終反應(yīng)體系為10 μL，包括2×rTaq酶5 μL；引物P1、P2、P3、P4各為0.5 μL；模板0.5 μL；去離子水2.5 μL。最佳反應(yīng)程序：95℃ 5 min； 95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s ，共35個(gè)循環(huán)； 72℃ 10 min(圖3,4)。以優(yōu)化后的復(fù)合PCR的反應(yīng)條件，將EV-E和EV-F的混合cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見(jiàn)混合cDNA組同時(shí)擴(kuò)增出2條帶，其大小與單一cDNA組擴(kuò)增條帶相同(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2.5 μL;3.10 μL;4.15 μL;5.20 μL;6.25 μL;7.30 μL

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2.51℃;3.52℃;4.53℃;5.54℃;6.55℃;7.56℃;8.57℃;9.58℃;10.59℃;11.60℃

2.3 復(fù)合PCR特異性結(jié)果應(yīng)用復(fù)合PCR方法分別擴(kuò)增EV-E和EV-F混合cDNA、牛細(xì)小病毒cDNA、牛病毒性腹瀉病毒cDNA。除EV-E和EV-F混合cDNA組擴(kuò)增出2條特異性條帶，其余均未擴(kuò)增出條帶，表明復(fù)合PCR具有良好的特異性(圖6)。

2.4 復(fù)合PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果將紫外分光光度計(jì)測(cè)定的pMD18-EV-E和pMD18-EV-F質(zhì)粒充分混勻后，確定出pMD18-EV-E和pMD18-EV-F的初始拷貝數(shù)約為 3.67×1010， 5.21×1010拷貝/μL。以10-1～10-10的梯度進(jìn)行稀釋，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建立的復(fù)合PCR方法檢測(cè)EV-E和EV-F的最低檢測(cè)滴度為 3.67×102，5.21×103拷貝/μL(圖7)。

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2.復(fù)合PCR擴(kuò)增EV-E和EV-F混合cDNA產(chǎn)物;3.EV-E PCR產(chǎn)物;4.EV-F PCR產(chǎn)物

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2.EV-E和EV-F混合cDNA擴(kuò)增結(jié)果;3～4.復(fù)合PCR擴(kuò)增牛細(xì)小病毒和牛病毒性腹瀉病毒結(jié)果

2.5 復(fù)合PCR的重復(fù)性結(jié)果以復(fù)合PCR分別對(duì)3份樣品進(jìn)行3次重復(fù)性檢測(cè),結(jié)果EV-E和EV-F均為陽(yáng)性,且陰性對(duì)照正常(圖略),說(shuō)明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.6 復(fù)合PCR的初步應(yīng)用結(jié)果用建立的復(fù)合PCR方法和ELISA方法對(duì)32份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。所建立的復(fù)合PCR方法檢測(cè)出的EV-E陽(yáng)性數(shù)為9份(陽(yáng)性率28.13%)，EV-F陽(yáng)性數(shù)為11份(陽(yáng)性率34.38%),混合感染率為15.63%。與ELISA檢測(cè)結(jié)果符合率為100.0%(圖8,表2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～11.pMD18-EV-E和pMD18-EV-F混合質(zhì)粒作10-1～10-10稀釋后的復(fù)合PCR結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～11.部分糞便樣品的復(fù)合PCR結(jié)果

表2 RT-PCR和ELISA檢測(cè)臨床樣品結(jié)果

3 討論

BEV感染為國(guó)內(nèi)新發(fā)的傳染病，有關(guān)本病的研究近年來(lái)雖然取得了一些進(jìn)展，但其診斷方法與流行病學(xué)研究仍然缺乏。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè) BEV感染的方法主要有病毒分離、RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、雙抗體夾心ELISA等方法[16-18]，這些方法雖然在確定國(guó)內(nèi)牛群存在新發(fā)EV-E和EV-F感染方面發(fā)揮了重要作用，但由于它們只針對(duì)單一病毒血清型或基因型，因而在診斷 BEV感染中，難以揭示出牛群中的真實(shí)感染情況。本課題組前期對(duì)國(guó)內(nèi)不同地區(qū) BEV感染進(jìn)行流行病學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)許多地區(qū)的牛群同時(shí)存在EV-E和EV-F病毒混合感染的情況[13-15]，導(dǎo)致 BEV感染的診斷與防控更加復(fù)雜。為了能夠迅速同時(shí)確定出牛群中感染BEV的基因型或血清型，本研究基于對(duì)EV-E和EV-F的基因組的比對(duì)分析結(jié)果，分別設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增EV-E和EV-F的引物，并以此建立了可以依據(jù)擴(kuò)增片段的大小進(jìn)而鑒別EV-E和EV-F感染的復(fù)合PCR方法。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的復(fù)合PCR僅能夠檢測(cè)出 BEV，具有較高的特異性；敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法具有較高的敏感性和良好的重復(fù)性，且快速簡(jiǎn)便，可用于 BEV基因型/血清型的鑒別及診斷與流行病學(xué)調(diào)查研究。

本試驗(yàn)同時(shí)將2對(duì)引物的GC含量控制在50%～59%，以盡量降低GC含量差異對(duì)復(fù)合PCR的影響。在進(jìn)行PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用25 μL體系進(jìn)行復(fù)合PCR反應(yīng)時(shí)，EV-E的擴(kuò)增效率明顯高于EV-F的擴(kuò)增效率，導(dǎo)致EV-F檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。而在10 μL反應(yīng)體系下，兩種引物擴(kuò)增效率都比較高，從而使同時(shí)高效檢測(cè)EV-E和EV-F成為可能。