孔令臻，邢 捷

臨床將經(jīng)積極正規(guī)治療1 個(gè)月以上仍不能愈合的潰瘍定義為慢性難愈性潰瘍，外傷、糖尿病、下肢靜脈曲張等皆可引發(fā)，嚴(yán)重影響患者工作及生活質(zhì)量[1]。針對(duì)慢性難愈性潰瘍后期腐祛肌不生的臨床難題，上海市名中醫(yī)唐漢鈞教授創(chuàng)新性地提出了祛瘀生肌和補(bǔ)虛生肌的治療方法，而補(bǔ)益氣血法是補(bǔ)虛生肌的重要方法，臨床療效顯著[2]。慢性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)的快慢與肉芽組織的生長(zhǎng)息息相關(guān)，創(chuàng)面肉芽組織的主要成分是成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管。慢性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中皮膚成纖維細(xì)胞分泌的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等細(xì)胞因子起關(guān)鍵性作用[3]。

八珍湯是補(bǔ)益氣血的代表方劑，前期動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)八珍湯內(nèi)服能促進(jìn)大鼠難愈性創(chuàng)面肉芽組織成纖維細(xì)胞增殖，加快創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[4-5]。本實(shí)驗(yàn)從體外實(shí)驗(yàn)角度進(jìn)一步研究不同濃度八珍湯對(duì)體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表達(dá)的影響，探索中醫(yī)藥促進(jìn)創(chuàng)面愈合的有效藥物及其作用機(jī)制和合理濃度，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人表皮成纖維細(xì)胞(HSF)，購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司(批號(hào)：02.ZQ0781)。

1.1.2 藥物與試劑 八珍湯(《正體類(lèi)要》)由黨參9 g，白術(shù)9 g，茯苓9 g，熟地黃12 g，當(dāng)歸9 g，白芍藥9 g，川芎6 g，甘草6 g 組成。將以上中藥煎取、濃縮、凍存、升發(fā)后制備成凍干粉。黨參，產(chǎn)地甘肅，上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆ㄅ?hào)：180208）；白術(shù)，產(chǎn)地安徽，上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆ㄅ?hào)：180327-1）；茯苓，產(chǎn)地湖北，上海萬(wàn)仕城藥業(yè)有限公司（批號(hào)：180103-1）；熟地黃，產(chǎn)地河南，上海康橋中藥飲片有限公司（批號(hào)：180126）；當(dāng)歸，產(chǎn)地甘肅，上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司（批號(hào)：180411）；白芍藥，產(chǎn)地安徽，上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆ㄅ?hào)：180331）；川芎，產(chǎn)地四川，上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆ㄅ?hào)：180122）；甘草，產(chǎn)地新疆，上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆ㄅ?hào)：180323）。異丙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：8109218）；氯仿，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：10006818）；Western轉(zhuǎn)膜液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：P0021B）；Trizol，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（批號(hào)：10296010）；SDS-PAGE 電泳液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：P0014B）；Anti-EGF，英國(guó)Abcam 公司（批號(hào)：ab184265）；Anti-VEGF，英國(guó)Abcam 公司（批號(hào)：ab52917）；Anti-TGF-β，英國(guó)Abcam 公司（批號(hào)：ab179695）；10×TBS 溶液，中國(guó)Biosharp（BL608A）（批號(hào)：BL608A）；RIPA 裂解液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：P0013B）；TEMED，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：ST728）；蛋白上樣緩沖液（5×），上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：550825）；Tween-20，BBI life science（批號(hào)：9005-64-5）；BSA Albumin Fraction V，德國(guó)Biofroxx 公司（批號(hào)：143065）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：P0010）；1 mol/L Tris-HCL，pH8.8，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：ST788）；1 mol/L Tris-HCL，pH6.8，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：ST768）；10%SDS，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：ST628）；APS，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：ST005）；無(wú)水乙醇，上海生工生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：SII30256.01B）；PMSF，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：ST506）；PBS，美國(guó)Gibco公司（批號(hào)：AC10260338）；ECL 顯色試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：P0018FS）；蛋白Marker，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（批號(hào)：26617）；CCK-8 試劑，中國(guó)GENVIEW 公司（批號(hào)：GK3607-500T）。

1.1.3 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠（型號(hào)：RE-2000A）；冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司（型號(hào)：LGJ-10D）；萬(wàn)分之一電子分析天平，德國(guó)Sartorius 公司（型號(hào)：BSA124S）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司（型號(hào)：5424R）；超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司（型號(hào)：SB25-12DTD）；酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek 公司（型號(hào)：Synergy H1MF）；倒置式顯微鏡，日本Nikon 公司（型號(hào)：TS-100）；流式細(xì)胞分析儀，美國(guó)Beckman coulter 公司（型號(hào)：Cytoflex）；蝸旋振蕩器，江蘇其林貝儀器制造有限公司（型號(hào)：QL861）；30L 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠（型號(hào)：BXM-30R）；Adventurer 精密天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司（型號(hào)：AR224CN）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific 公司（型號(hào)：371）；凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司(型號(hào)：Chemiscope6300)；攪拌器，其林貝爾儀器制造有限公司(型號(hào)：GL-3250B)；掌上型離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific 公司（型號(hào)：MYSPIN6）；恒溫水浴鍋，上海華連公司（型號(hào)：DK-S12）；-80 ℃冰箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（型號(hào)：700）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人皮膚成纖維細(xì)胞復(fù)蘇轉(zhuǎn)移至37℃，于5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)24 h 后先在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，然后將培養(yǎng)皿移至超凈臺(tái)內(nèi)更換培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)，將4～6 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組與干預(yù) 制備八珍湯凍干粉。對(duì)照組：予含完全DMEM 培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)。不同濃度八珍湯組：予含10 μg/L～1 g/L 八珍湯的完全DMEM培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法 將人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)。選用第4～6 代細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)采用CCK-8 法測(cè)定不同濃度八珍湯對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響，采用免疫印跡分析（Western blotting）法檢測(cè)不同濃度八珍湯對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞合成分泌EGF、TGF-β1、VEGFA的影響。

1.4.1 細(xì)胞增殖 細(xì)胞鋪板后藥物干預(yù)細(xì)胞，將96 孔細(xì)胞板轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)內(nèi)，吸棄原培養(yǎng)液，每孔分別加入100 μL 的完全培養(yǎng)液，10 μg/L、100 μg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、1 g/L 的八珍湯，每組設(shè)置4 個(gè)副孔。將3 板96 孔細(xì)胞板重新移到37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h及48h。檢測(cè)光密度（OD）值：將96 孔細(xì)胞板轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)內(nèi)，吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基以及10 μL CCK-8 試劑，將96 孔細(xì)胞板轉(zhuǎn)移到37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。1 h 后將96 孔細(xì)胞板移到酶標(biāo)儀下于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)OD 值（OD450）。

1.4.2 EGF、TGF-β1、VEGFA 蛋白表達(dá) 細(xì)胞蛋白提取后用BCA 法測(cè)蛋白濃度，蛋白變性后電泳。配一抗，用5%BSA 按1︰1000 稀釋一抗，滴加一抗于Parafilm 膜，將PVDF 膜小心覆蓋于一抗上，4℃過(guò)夜。用1×PBST 洗滌4 次，每次10 min。配 二 抗，用5% BSA 以1︰10000 稀 釋HRP 標(biāo)記的二抗。滴加二抗于小盒中，膜置入小盒中，室溫孵育60 min。用1×PBST 洗滌6 次，每次5 min。準(zhǔn)備ECL 化學(xué)發(fā)光顯色劑，將膜從PBST 中取出，用吸水紙稍吸干燥，滴加ECL 顯色液，掃描及分析。一抗孵育，二抗孵育并顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度八珍湯對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響 八珍湯（10 μg/L～1 g/L）干預(yù)人皮膚成纖維細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比較，八珍湯（100 μg/L～1 g/L）能促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。八珍湯（10 μg/L～1 g/L）干預(yù)人皮膚成纖維細(xì)胞48 h，與對(duì)照組相比較，細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度八珍湯干預(yù)24 h 及48 h 對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響

2.2 不同濃度八珍湯對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表達(dá)的影響 經(jīng)過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)篩選，選擇八珍湯作用人皮膚成纖維細(xì)胞24 h，檢測(cè)低濃度（10 mg/L）、中濃度（100 mg/L）、高濃度（1 g/L）八珍湯對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，100 mg/L 八珍湯組EGF、TGF-β1 的表達(dá)増高，1 g/L 八珍湯組EGF、TGF-β1 表達(dá)降低（P<0.05）；10 mg/L 八珍湯組EGF、TGF-β1表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）。與對(duì)照組比較，10 mg/L 八珍湯組VEGFA 的表達(dá)增高（P<0.05），100 mg/L 八珍湯組VEGFA 的表達(dá)明顯增高（P<0.01），1 g/L 八珍湯組VEGFA 的表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 不同濃度八珍湯對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表達(dá)的影響

表2 不同濃度八珍湯對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表達(dá)的影響

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為皮膚潰瘍的起發(fā)、破潰、收口與氣血的盛衰息息相關(guān)，皮膚肌肉失于“氣血”的溫煦與濡養(yǎng)則易引起創(chuàng)面的發(fā)生，氣血虛弱者創(chuàng)面不易愈合，預(yù)后不良。中醫(yī)認(rèn)為慢性潰瘍氣血兩虛的患者應(yīng)遵循補(bǔ)益氣血的治療方法，在治療過(guò)程中，從“虛”入手，補(bǔ)益氣血中藥治療慢性潰瘍?nèi)〉昧己茂熜6]。八珍湯作為氣血雙補(bǔ)方劑，臨床常用來(lái)治療各種慢性疾病以及大病、久病病后虛弱，瘡瘍久不收口等氣血兩虛者，能通過(guò)提高血紅蛋白以及紅細(xì)胞改善血循環(huán)，在提高免疫力的同時(shí)，對(duì)皮膚也是一種保護(hù)[7-9]。

創(chuàng)面愈合過(guò)程主要包括炎癥期、新生組織形成期及組織重塑期三個(gè)序貫交叉進(jìn)行的階段[10]。在新生組織形成期及組織重塑期，成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是重要的組織修復(fù)細(xì)胞，它能在修復(fù)過(guò)程中提供框架作用，在創(chuàng)面收縮過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11]。EGF 是細(xì)胞重要的有絲分裂原，促使細(xì)胞增殖、成熟，加速衰老細(xì)胞的替代及膠原蛋白合成，促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，同時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞遷移至受損部位，進(jìn)而加速創(chuàng)面愈合[12-14]。VEGFA幾乎參與了血管生成的整個(gè)過(guò)程。在血管生成過(guò)程中，VEGFA 作為VEGF 促進(jìn)基底膜分解的主要因子，能加速血管新生。血管新生可為創(chuàng)面肉芽組織、細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)與氧氣，在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中起著重要作用。TGF-β1 在創(chuàng)面愈合過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，它可促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化并能促進(jìn)細(xì)胞遷移，同時(shí)直接影響膠原的合成和分泌[15-16]。TGF-β1 是TGF-β 家族中的重要因子，它通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）結(jié)合而活化，通過(guò)TGFβ1-Smad 通路蛋白活化巨噬細(xì)胞，使其產(chǎn)生促血管化的細(xì)胞因子，同時(shí)促進(jìn)成纖維細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞的增殖遷移以及改善創(chuàng)面炎癥免疫反應(yīng)，激化肉芽組織生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成，完成創(chuàng)面重塑[17-19]。

前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)益氣血中藥八珍湯能促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織成纖維細(xì)胞增殖，抑制成纖維細(xì)胞凋亡，促進(jìn)大鼠難愈性潰瘍創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間[4-5]。本實(shí)驗(yàn)從體外實(shí)驗(yàn)角度，進(jìn)一步研究不同濃度八珍湯對(duì)體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表達(dá)的影響，探索中醫(yī)藥促進(jìn)創(chuàng)面愈合的有效藥物及其作用機(jī)制和合理濃度。為了觀察八珍湯對(duì)體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響以及篩選合理藥物濃度及最佳用藥時(shí)間，采用不同濃度八珍湯對(duì)4～6 代人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，CCK-8 法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明八珍湯能促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖，在濃度為1 mg/L～1 g/L 時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖效果較明顯，且藥物干預(yù)24 h 促細(xì)胞增殖效果明顯。經(jīng)過(guò)CCK-8 法實(shí)驗(yàn)篩選，選擇八珍湯作用于人皮膚成纖維細(xì)胞24h，檢測(cè)低濃度（10 mg/L）、中濃度（100 mg/L）、高濃度（1 g/L）八珍湯對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)中濃度八珍湯(100 mg/L)能促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞EGF、TGF-β1、VEGFA 表達(dá)，低濃度八珍湯(10 mg/L)促進(jìn)EGF、TGF-β1 表達(dá)效果并不明顯，高濃度八珍湯(1 g/L)對(duì)于EGF、TGF-β1表達(dá)出現(xiàn)不同程度的抑制作用。

氣充則可外達(dá)溫煦肌膚，血足則能潤(rùn)澤、濡養(yǎng)肌膚，氣血關(guān)系密切，氣血能相互轉(zhuǎn)化，氣能生血，血能養(yǎng)氣。成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管是肉芽組織的主要成分，中濃度八珍湯可能通過(guò)氣血雙補(bǔ)使皮膚得到充分溫煦與濡養(yǎng)，在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，生長(zhǎng)因子EGF、TGF-β1、VEGFA 表達(dá)的同時(shí)，加速細(xì)胞遷移，通過(guò)激化產(chǎn)生血管化的因子促進(jìn)血管化，加速血管新生，促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)，最終促進(jìn)創(chuàng)面愈合。該結(jié)果與前期的大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，證實(shí)了氣血對(duì)肌膚的濡養(yǎng)作用。