李冬琳，管忠安

潰瘍性直腸炎（UP）是一種以腹痛、腹瀉或便秘、里急后重，或伴黏液膿血便的非特異性慢性炎癥性疾病，腹痛多以左下腹為主，病程呈間歇性發(fā)作。近年來(lái)我國(guó)發(fā)病率不斷增長(zhǎng)[1]。西醫(yī)多采用口服藥物治療，雖能較快控制病情，但長(zhǎng)期使用存在一定副作用且復(fù)發(fā)率高[2]。近年來(lái)中藥灌腸治療結(jié)直腸炎因療效佳、安全性高受到歡迎[3]。復(fù)方黃柏液涂劑是由連翹、黃柏、金銀花、蒲公英、蜈蚣五味清熱解毒藥物組成的中成藥，其中連翹、蒲公英、蜈蚣消腫散結(jié)消炎，蜈蚣還可活血走竄；黃柏清熱燥濕、瀉火解毒；金銀花疏散風(fēng)熱、涼血止??；諸藥合用可清熱解毒、散癰消腫去腐，用于瘡瘍潰后傷口感染屬陽(yáng)證者。中醫(yī)學(xué)以“整體觀念”和“辯證論證”為指導(dǎo)思想，強(qiáng)調(diào)事物的統(tǒng)一和聯(lián)系性，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)注重綜合、系統(tǒng)和集成性，這正與中醫(yī)學(xué)原則相契合[4]。故本研究運(yùn)用此方法，通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘、篩選整合、計(jì)算機(jī)模擬、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析，預(yù)測(cè)復(fù)方黃柏液涂劑與UP 作用靶點(diǎn)關(guān)系，并分析信號(hào)通路[5]。使分子生物學(xué)與中醫(yī)藥理論相結(jié)合，為臨床用藥提供理論支撐，為實(shí)驗(yàn)提供向?qū)В瑸橹嗅t(yī)藥現(xiàn)代化提供思路。

1 資料與方法

1.1 復(fù)方黃柏液涂劑活性化合物篩選 以口服利用度OB ≥30%、腸道上皮滲透性Caco2 ≥0.5、類藥性DL ≥0.18 為條件，在TCMSP 篩選出連翹、黃柏、金銀花、蒲公英、蜈蚣的有效成分[6]。使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為Gene Symbol 并排除重復(fù)或無(wú)效靶點(diǎn)。

1.2 復(fù)方黃柏液涂劑成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將相關(guān)文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 疾病靶點(diǎn)的獲取 以“Ulcerative proctitis”為關(guān)鍵詞分別搜索Drugbank、OMIM 和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)查找UP 相關(guān)靶點(diǎn)，匯總后通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)Gene Symbol,排除重復(fù)或無(wú)效靶點(diǎn)。

1.4 潰瘍性直腸炎蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將UP 疾病有效靶點(diǎn)基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/cgi/input.pl）中，導(dǎo)出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 藥物與疾病靶點(diǎn)交互關(guān)系分析 將藥物和疾病有效靶點(diǎn)Gene Symbol 輸入VENNY.2,找出交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.6 復(fù)方黃柏液涂劑-UP 共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 通過(guò)Cytoscape3.8.2 作出藥物-疾病共同靶點(diǎn)圖。

1.7 基于DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析 將藥物與疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）,對(duì)其進(jìn)行GO 和KEGG 分析，得到相關(guān)數(shù)據(jù)，并使用微生信（www.bioinformatics.com.cn）作出GO 柱形圖和KEGG氣泡圖。

1.8 關(guān)鍵化合物與核心靶蛋白的分子對(duì)接模擬分析 取調(diào)控及PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名均靠前靶點(diǎn)作為最佳靶點(diǎn)，在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（（http://www.rcsb.org/）中導(dǎo)出其對(duì)應(yīng)PDB 格式分子結(jié)構(gòu)文件；在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)出靶點(diǎn)數(shù)量排名靠前化合物的mol2 格式分子結(jié)構(gòu)文件。采用Ledock 軟件（http://www.lephar.com/）對(duì)上述靶點(diǎn)和化合物進(jìn)行分子對(duì)接模擬，得到最小結(jié)合能[7]。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物及有效靶點(diǎn)篩選 最終篩選出可納入的活性化合物共 57 個(gè)，其中連翹17 個(gè)，黃柏25 個(gè)，金銀花10 個(gè)，蒲公英4 個(gè)，蜈蚣1 個(gè)。通過(guò)Uniprot 將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為Gene Symbol,整理后最終得到111 個(gè)有效靶點(diǎn)。

2.2 復(fù)方黃柏液涂劑成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物中57 個(gè)成分及111 個(gè)靶點(diǎn)構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，如圖1 所示。

圖1 復(fù)方黃柏液涂劑成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 UP 疾病靶點(diǎn)獲取 經(jīng)篩選整理后，最終得到疾病有效靶點(diǎn)68 個(gè)。

2.4 UP 蛋白互作PPI 圖 將UP 有效靶點(diǎn)導(dǎo)入String，構(gòu)建UP PPI 圖。

2.5 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交互關(guān)系分析 分析顯示，藥物111 個(gè)有效靶點(diǎn)中有11 個(gè)同時(shí)為UP 相關(guān)靶點(diǎn)，如圖3 所示。

圖2 潰瘍性直腸炎蛋白互作圖

圖3 復(fù)方黃柏液涂劑-潰瘍性直腸炎交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.6 交集靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化 在Cytoscape 軟件將交集靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化，見(jiàn)圖4。

圖4 藥物-疾病交集靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 復(fù)方黃柏液涂劑對(duì)UP 作用靶點(diǎn)GO 功能富集注釋分析 GO 分析包括110 個(gè)生物過(guò)程（BP）、9 個(gè)細(xì)胞組分（CC）、9 個(gè)分子功能（MF）。如圖5 所示。

圖5 GO 分析柱形圖

BP 分析顯示，干預(yù)過(guò)程可能與炎癥反應(yīng)、藥物反應(yīng)、胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK1 和ERK2 聯(lián)合正調(diào)控、序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等相關(guān)；CC 分析顯示，可能與胞外區(qū)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體、血小板a 顆粒腔等細(xì)胞組分相關(guān)；MF分析顯示，可能與蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子活性、酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)同聚活性、前列腺素-內(nèi)過(guò)氧化物合成酶活性等分子功能相關(guān)。

2.8 復(fù)方黃柏液涂劑對(duì)UP 作用靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析 KEGG 通路富集共包括38 條，取基因占比前15 名作出可視化氣泡圖。如圖6 所示。

圖6 KEGG 通路分析圖

KEGG 分析顯示，干預(yù)過(guò)程最可能與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、瘧疾、炎癥性腸病、乙肝通路、核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域NOD 類似受體信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF 信號(hào)通路等相關(guān)。

2.9 分子對(duì)接結(jié)果 取調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)中均排名靠前的4 個(gè)靶點(diǎn)前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶1（PTGS1）、過(guò)氧化物酶體增生激活受體(PPARG)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（KDR）、重組人白細(xì)胞介素6（IL-6）作為最佳靶點(diǎn)，分別與靶點(diǎn)數(shù)量排名前11 的關(guān)鍵化合物進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接評(píng)分為負(fù)值時(shí)，表示二者具有作用力，對(duì)接評(píng)分絕對(duì)值＞4.25 時(shí)，表示二者具備一定結(jié)合活性[8]。由表1 可知，上述4 個(gè)靶點(diǎn)與化合物的結(jié)合能均為負(fù)值且絕對(duì)值＞4.25 的超95%，說(shuō)明復(fù)方黃柏液涂劑中有較多組分能與UP 蛋白網(wǎng)絡(luò)較好結(jié)合，即對(duì)UP 可多靶點(diǎn)干預(yù)。

表1 分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

復(fù)方黃柏液涂劑活性化合物共57 個(gè)，可作用于UP 的靶點(diǎn)達(dá)111 個(gè)。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，連翹中的漢黃芩素、β-谷甾醇；黃柏中的豆甾醇、藍(lán)堇堿、異紫堇杷明、黃連素、去氫丹參酮ⅡA、原阿片堿、咖維定；金銀花中的β-胡蘿卜素等為連接節(jié)點(diǎn)數(shù)較多的核心化合物。而靶點(diǎn)則以KDR、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）、PPARG、β2 腎上腺素能受體(ADRB2)、重組人趨化因子(CXCL8)、PTGS1、核受體共激活因子2（NCOA2）、IL6 的連接節(jié)點(diǎn)數(shù)最多。在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，腫瘤壞死因子TNF、PPARG、KDR、PTGS1、PTGS2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGFB1）、CXCL8、IL6、4 等具有較多連接節(jié)點(diǎn)數(shù)，在調(diào)控通路中處核心地位。PTGS1、IL6、KDR、PPARG 在二者中均排前位，因此為最佳靶點(diǎn)。從分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)11 個(gè)關(guān)鍵化合物與上述四個(gè)靶蛋白對(duì)接結(jié)合能均為負(fù)數(shù)且絕對(duì)值較大，可知，藥物對(duì)UP 的干預(yù)效果總體較好。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[9]。其可通過(guò)增強(qiáng)超氧化物歧化酶SOD 活性、抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）炎性因子的釋放與聚集等途徑發(fā)揮黏膜保護(hù)作用[10]。漢黃芩素為黃酮類化合物，可通過(guò)減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生及抑制其與特異性受體結(jié)合能力發(fā)揮抗炎抗腫瘤作用[11]。豆甾醇可抑制細(xì)胞遷移、介導(dǎo)線粒體凋亡，抑制腫瘤發(fā)展。β-胡蘿卜素具有抗氧化能力，也可減輕炎癥反應(yīng)[12]。PTGS1、PTGS2是一種誘導(dǎo)酶，其上調(diào)與腫瘤血管生成有關(guān)，在癌細(xì)胞中是生產(chǎn)前列腺素E2（PGE2）的關(guān)鍵一步[13-14]。TNF 由活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可誘發(fā)某些腫瘤細(xì)胞死亡，參與全身炎癥反應(yīng)。PPARG 可參與炎癥反應(yīng)、凋亡及癌癥等過(guò)程。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）可特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制細(xì)胞凋亡，其表達(dá)與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)[15]。IL4、IL6、CXCL8 均屬白細(xì)胞介素類，在激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞及炎癥反應(yīng)中起重要作用[16]。因此，無(wú)論從化合物還是靶點(diǎn)方向考慮，干預(yù)過(guò)程都與炎癥反應(yīng)、癌癥通路密切相關(guān)，這與GO 及KEGG分析結(jié)果相一致。曾有研究顯示，UP 疾病發(fā)展的主要因素包含TNF、IL、PTGS2 等[17-18]。相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)復(fù)方黃柏液涂劑各成分確有消炎抗菌、抗腫瘤、抗瘡瘍作用[19-20]。這些均與本研究結(jié)果相符合。

復(fù)方黃柏液涂劑當(dāng)前研究大多停留在臨床觀察層面，缺乏分子機(jī)制、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和基因水平相關(guān)研究[21-23]。本研究闡明了潛在靶點(diǎn)基因、分子機(jī)制，以完善其研究體系，但同時(shí)也存在著一定局限性：大量信息的獲取依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)，但其信息完整性及準(zhǔn)確性有待商榷；藥物在不同個(gè)體及同一個(gè)體不同代謝過(guò)程均有差別，故預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)難保準(zhǔn)確且中藥各指標(biāo)無(wú)法量化；停留于計(jì)算機(jī)模擬而未經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。故網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展需依靠數(shù)據(jù)庫(kù)的加強(qiáng)完善，同時(shí)需結(jié)合血清檢查、藥效藥動(dòng)學(xué)從而加強(qiáng)量化分析，且最好進(jìn)行動(dòng)物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[24-25]。

綜上所述，復(fù)方黃柏液涂劑可通過(guò)多通路、多靶點(diǎn)有效干預(yù)潰瘍性直腸炎，且藥效成分與疾病基因分子對(duì)接較好。但此結(jié)論尚需進(jìn)一步深入驗(yàn)證。