史春雨 陳紅紅 景 婷 陳楚言 莫名月 羅煥敏 高勁松

原發(fā)性肝癌為我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，也是世界性最高發(fā)的癌癥之一[1]。近幾十年來全世界肝癌的發(fā)病率、死亡率呈不斷上升趨勢(shì)，但目前肝癌的臨床治療效果并不樂觀，存在手術(shù)治療費(fèi)用昂貴且預(yù)后差，化療副作用大等問題。因此從肝癌的發(fā)病機(jī)制入手，尋找新的具有抗癌作用的生物活性分子，必將給原發(fā)性肝癌的治療帶來突破[2]。羽扇豆醇屬于三萜類化合物，分子式為C30H50O，分子量為426.72，它廣泛存在于多種水果、蔬菜和中草藥等植物中。大量研究表明，羽扇豆醇具有抗癌效應(yīng)，對(duì)機(jī)體器官和組織細(xì)胞如肝臟和心臟具有保護(hù)作用，且表現(xiàn)出了對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性[3，4]。本項(xiàng)目旨在通過研究其對(duì)p38-MAPK信號(hào)通路特異性靶點(diǎn)的影響，探討其對(duì)肝細(xì)胞癌的抑制作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：12只4-5周齡的SPF級(jí)BALB/C雄性裸鼠，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：44007200030605。所有小鼠飼養(yǎng)條件均為晝夜各半，食物飲水不限制，室溫，55% 濕度。

1.1.2 細(xì)胞：HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞，由廣州萊德爾生物科技有限公司提供。

1.1.3 主要試劑：羽扇豆醇(Lupeol)(美國(guó)Sigma公司)；細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清(Hyclone公司，Cat.No.SH30087.01)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司，Cat.No.SH30809.01B)；二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma公司)；鏈霉素(Hyclone公司，Cat.No. SH30010)；PBS磷酸鉀緩沖液(Hyclone公司，Cat.No.SH30256.01B)；單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑cellTiter96AQ(Promega，Cat.No.G3582)；SYBR Green qPCR SuperMix(Invitrogen公司)；HRP標(biāo)記的GAPDH優(yōu)質(zhì)內(nèi)參(上?？党缮镉邢薰?，貨號(hào)為KC-5G5)；一抗(Abcam)；二抗：兔抗鼠IgG (H+L)(Southern Biotech公司，貨號(hào)為6170-05)、山羊抗兔IgG (H+L Chain Specific)(Southern Biotech公司，貨號(hào)為4050-05)、過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG(武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)為BA1060)、過氧化物酶標(biāo)記兔抗大鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)為BA1058)；發(fā)光液Immobilon Western Chemilum HRP Substrate(Millipore公司，貨號(hào)為WBKLS0500)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Keygen，貨號(hào)KGA106)； Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco，批號(hào)為31985-070)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen，批號(hào)為 11668-019)；所用熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒pGL3-Basic及pGL3-ERK1/2-promoter由載體組提供。

1.1.4 主要儀器：細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific, HERACELL150i) ；倒置熒光顯微鏡(Leica，型號(hào)為DMI6000B)；艾本德核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)，BioPhotometer Plus)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI PRISM?7500 Sequence Detection System)；蘇州安泰潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-IFD)； 低速離心機(jī)(中佳，SC3614)；倒置光學(xué)顯微鏡 (OLYMPUS CKX41, U-CTR30-2)；流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur)； 酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，型號(hào)為Multiscan MK3)；Luciferase活性檢測(cè)系統(tǒng)為Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司，E1910)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為HepG2小鼠對(duì)照組、HepG2小鼠羽扇豆醇組、Huh7小鼠對(duì)照組及Huh7小鼠羽扇豆醇組，每組3只。分別將細(xì)胞密度為 1×106/ml 的HepG2、Huh7細(xì)胞懸液接種于對(duì)應(yīng)組的裸小鼠背部皮下，細(xì)胞懸液接種量均為 0.1ml，接種后隨時(shí)觀察腫瘤的增長(zhǎng)情況。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)篩選確定本研究中小鼠的羽扇豆醇治療劑量為0.5mg/只。接種細(xì)胞14天后，分別對(duì)HepG2小鼠羽扇豆醇組和Huh7小鼠羽扇豆醇組進(jìn)行腹腔給藥，劑量為0.5mg/只，其余組則予等量生理鹽水，連續(xù)給藥14天。

1.2.2 腫瘤標(biāo)本采集與檢測(cè)：待肉眼能觀察到腫瘤時(shí)，開始用微米卡尺測(cè)腫瘤體積，每周測(cè)量2-3次。按以下公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積=[(長(zhǎng)徑×短徑2)/2(mm3)]，末次給藥 24h后，采用脫頸法將小鼠處死，取其皮下腫瘤組織稱重，-80℃凍存，待用。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和分組:將人肝癌 HepG2和Huh7細(xì)胞株用含10%小牛血清、青鏈霉素各100μ/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液在37 ℃, 5% CO2,濕度為90%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別使用4mg/L的順鉑、二甲基亞砜、60mg/L的羽扇豆醇處理HepG2與Huh7細(xì)胞株24h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，分別記為HepG2順鉑組、HepG2溶劑組、HepG2羽扇豆醇組和Huh7順鉑組、Huh7溶劑組、Huh7羽扇豆醇組，未作其它處理的細(xì)胞為HepG2對(duì)照組和Huh7對(duì)照組。

1.2.4 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖：分別離心收集各組細(xì)胞接種于含RPMI 1640培養(yǎng)液的96孔板上(細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml)，每孔100μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0h、24h、48h和72h加入單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑，每孔10μl。孵育4h后加入 DMSO,MTS檢測(cè)讀取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)490nm處吸光度(OD)值。重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：用2ml的PBS緩沖液洗滌各組細(xì)胞2次，1 000g離心5min，棄去上清液，加入0.5ml的0.25%胰酶消化孵育，加入含血清的培養(yǎng)基并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使得密度大約為1×106個(gè)/ml。各組取0.5ml細(xì)胞懸液加入1.25μl的Annexin V-FITC，室溫(18-24℃)避光反應(yīng)15min后，室溫1 000g離心5min，棄去上清液。再用0.5ml預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸，加入10μl的Propidium Iodide后置于冰上避光保存，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.6 質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性：將p38相關(guān)基因的promoter關(guān)鍵區(qū)域克隆至pGL3-Basic熒光素酶報(bào)告基因載體，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析證實(shí)基因ERK1/2 promoter已成功克隆至pGL3-Basic載體中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，質(zhì)粒為：pGL3-ERK1/2-promoter。取對(duì)數(shù)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞, 接種于含RPMI 1640培養(yǎng)液的24孔板上(細(xì)胞終濃度為5×104個(gè)/ml),每孔100μl,于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h后,每孔吸取pGL3-ERK1/2-promoter質(zhì)粒母液(0.5 μg/μl)2μl溶解到250μl的Opti-MEM培養(yǎng)基為A液，取4μl的 LipofectamineTM2000溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基混合5min為B液，將A液和B液混合，靜置20min后加到細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4h換為含10%FBS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，收樣進(jìn)行雙熒光檢測(cè)。

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，將合格RNA樣品進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。取1.0μg的RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)，以18srRNA作為內(nèi)參基因,檢測(cè)絲裂原活化蛋白激酶超家族相關(guān)基因p38、ERK1/2、JNK、C-jun、MEKK1、c-MYC的mRNA相對(duì)表達(dá)量。各引物序列如表1所示。qPCR反應(yīng)程序?yàn)?50℃ 2min；95℃ 2min；95℃ 15s，60℃ 32s讀板，40個(gè)循環(huán)。以Ct法表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量,每組樣品設(shè)3個(gè)重復(fù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

表1 檢測(cè)片段大小及引物序列

1.2.8 Western blotting檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)：各組細(xì)胞分別加入裂解液充分裂解，14 000r/min 離心15min，取上清提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，SDS-PAGE電泳分離后進(jìn)行聚偏乙烯( PVDF) 膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h，一抗按 1∶1 000的比例稀釋后4 ℃孵育過夜，分別加入二抗：兔抗鼠 IgG (H+L)(1∶4 000)、山羊抗兔IgG (H+L Chain Specific)(1∶5 000)、過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG (1∶3 000)、過氧化物酶標(biāo)記兔抗大鼠IgG(1∶2 000)室溫孵育1h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，免疫印跡條帶應(yīng)用 Quntity One 4.62軟件進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH作為內(nèi)參，以目的蛋白與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體內(nèi)腫瘤質(zhì)量和體積比較

實(shí)驗(yàn)第28天，與HepG2小鼠對(duì)照組比較，HepG2小鼠羽扇豆醇組腫瘤質(zhì)量顯著減輕(t=14.63，P<0.01)；與Huh7小鼠對(duì)照組比較，Huh7小鼠羽扇豆醇組腫瘤質(zhì)量顯著減輕(t=11.02，P<0.01),見表2。而且羽扇豆醇作用的HepG2、Huh7組小鼠腫瘤體積于第17天、第20天、第23天及第26天時(shí)均顯著小于同細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

表2 不同實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤質(zhì)量均=3)

表3 各組小鼠腫瘤體積比較均=3)

2.2 各組細(xì)胞增殖比較

0h時(shí)，HepG2細(xì)胞各組以及Huh7細(xì)胞各組增殖情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與HepG2對(duì)照組和Huh7對(duì)照組比較，HepG2溶劑組和Huh7溶劑組各組細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)，而HepG2和Huh7順鉑組和羽扇豆醇組24h、48h、72h的細(xì)胞增殖顯著被抑制(P<0. 05)，且順鉑組抑制作用較羽扇豆醇組更顯著(P<0. 05)。見表4。

表4 不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖比較(OD值，均=3)

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較

HepG2細(xì)胞各組以及Huh7細(xì)胞各組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HepG2對(duì)照組和Huh7對(duì)照組比較，HepG2溶劑組和Huh7溶劑組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0. 05),而HepG2羽扇豆醇組、順鉑組和Huh7羽扇豆醇組、順鉑組細(xì)胞凋亡率均升高(P<0. 05)，但羽扇豆醇組細(xì)胞凋亡率的升高不及順鉑組(P<0. 05)。見圖1、表5。

圖1 各組細(xì)胞凋亡率(流式細(xì)胞術(shù))

表5 各組細(xì)胞凋亡率比較均=3)

2.4 各組細(xì)胞ERK1/2啟動(dòng)子熒光活性比較

與同細(xì)胞對(duì)照組轉(zhuǎn)染pGL3-Basic質(zhì)粒比較，轉(zhuǎn)染pGL3-ERK1/2-promoter 質(zhì)粒對(duì)照組的熒光活性增強(qiáng)(P<0. 05)，而與同細(xì)胞對(duì)照組轉(zhuǎn)染pGL3-ERK1/2-promoter 質(zhì)粒比較，羽扇豆醇處理組的ERK1/2啟動(dòng)子熒光活性降低，表現(xiàn)為一定的抑制作用，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)，但與同細(xì)胞羽扇豆醇組轉(zhuǎn)染pGL3-Basic質(zhì)粒比較，轉(zhuǎn)染pGL3-ERK1/2-promoter 質(zhì)粒羽扇豆醇組的ERK1/2啟動(dòng)子熒光活性增強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。見表6。

表6 不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的啟動(dòng)子活性檢測(cè)均=3)

2.5 各組細(xì)胞相關(guān)mRNA水平比較

HepG2細(xì)胞各組以及Huh7細(xì)胞各組 p38、ERK1/2、JNK、c-Jun、MEKK1、c-MYC mRNA水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。與HepG2對(duì)照組和Huh7對(duì)照組比較，HepG2溶劑組和Huh7溶劑組p38、ERK1/2、JNK、c-Jun、MEKK1、c-MYC mRNA水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0. 05)，而HepG2羽扇豆醇組、順鉑組和Huh7羽扇豆醇組、順鉑組p38、MEKK1 mRNA水平均升高，ERK1/2、JNK、c-Jun、c-MYC mRNA水平均降低(P<0. 05)，但羽扇豆醇組相關(guān)mRNA水平升高或降低均不及順鉑組明顯(P<0. 05)。見表7。

表7 各組細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)水平比較均=3)

2.6 各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

HepG2細(xì)胞各組以及Huh7細(xì)胞各組p38、ERK1/2、JNK、c-Jun、MEKK1、c-MYC蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。與HepG2對(duì)照組和Hun7對(duì)照組比較，HepG2溶劑組和Hun7溶劑組p38、ERK1/2、JNK、c-Jun、MEKK1、c-MYC蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)，而HepG2羽扇豆醇組、順鉑組和Huh7羽扇豆醇組、順鉑組p38、MEKK1蛋白水平升高，ERK1/2、JNK、c-Jun、c-MYC蛋白水平均降低(P<0. 05)，但羽扇豆醇組相關(guān)蛋白水平升高或降低不及順鉑組明顯(P<0. 05)。見圖2、表8。

圖2 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)(Western blotting)

表8 各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較均=3)

3 討 論

細(xì)胞凋亡又被稱為程序性細(xì)胞死亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療中起到重要的作用，通過誘導(dǎo)和調(diào)控凋亡通路來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前治療腫瘤的一個(gè)重要途徑。絲裂原活化蛋白激酶超家族(MAPK)是一族含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，廣泛的分布于細(xì)胞漿內(nèi)，可將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，是引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的重要信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。目前MAPK超家族在哺乳動(dòng)物中至少發(fā)現(xiàn)3種亞家族，分別為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38絲裂原活化蛋白激酶。MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞內(nèi)具有生物進(jìn)化的高度保守性，以三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)的形式(MAPKKK-MAPKK-MAPK)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。它們擁有各自的底物和調(diào)節(jié)蛋白激酶，接受不同的信號(hào)刺激[5，6]。許多抗腫瘤藥物都是通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗肝癌效應(yīng)的，在體外用順鉑誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中MAPKs(JIN/SAPKs, p38 MAPK, ERK)及轉(zhuǎn)錄因子(JUN，CREB)均有明顯表達(dá)[7]。羽扇豆醇是一種存在于多種植物中的天然成分，有大量的研究表明，羽扇豆醇對(duì)宮頸癌、胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌等多種腫瘤均顯示出抗癌活性,且研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的羽扇豆醇還可以逆轉(zhuǎn)致癌物對(duì)大鼠肝臟的損害，拮抗化療藥對(duì)大鼠心臟的毒性[8-10]。Bhattacharyya等[11]的一項(xiàng)研究顯示，羽扇豆醇單獨(dú)或與化療藥物聯(lián)合使用在頭頸腫瘤的治療中均具有一定的抑制作用。在口舌基底細(xì)胞癌裸鼠模型中，研究顯示羽扇豆醇增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性[12]。另外，有發(fā)現(xiàn)證明羽扇豆醇對(duì)人乳腺癌、人膀胱癌細(xì)胞均具有一定的抑制作用[13，14]。因此，羽扇豆醇是具有極大潛力的天然抗腫瘤藥物。在本項(xiàng)目前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2、Huh-7均具有抑制作用，且其抑制作用隨著羽扇豆醇的濃度增加而增強(qiáng)。并且同一濃度的羽扇豆醇處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間增加，羽扇豆醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用也不斷增強(qiáng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)經(jīng)羽扇豆醇處理過的HepG2、Huh-7細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)p38的mRNA水平顯著上調(diào)，且上調(diào)水平與羽扇豆醇的濃度具有一定的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羽扇豆醇可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示羽扇豆醇處理HepG2、Huh-7細(xì)胞后能夠從mRNA和蛋白水平提高p38MAPK信號(hào)通路中的p38和MEKK1的表達(dá)，降低ERK1/2、JNK、 c-Jun和c-MYC的表達(dá)，雖然其作用不及順鉑，但較對(duì)照組還是顯示出了一定的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。綜上所述，p38、MEKK1、ERK1/2、JNK、c-Jun和c-MYC參與了羽扇豆醇誘導(dǎo)的HepG2、Huh-7細(xì)胞的凋亡，推測(cè)羽扇豆醇是通過細(xì)胞表面死亡受體途徑誘導(dǎo)HepG2和Huh-7細(xì)胞凋亡的，從而提示羽扇豆醇在肝癌的治療中起著潛在的價(jià)值，也為人們對(duì)羽扇豆醇的深加工開發(fā)和合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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