★ 李養(yǎng)學(xué) 曾志浩 袁家鑫 李素梅 鐘惠嫻 黃華靖 江潔怡（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院 廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510095；.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州 51005；.中山大學(xué)新華學(xué)院 廣州 510520）

芪丹滋腎顆粒是廣東省第二中醫(yī)院的驗(yàn)方，對慢性腎炎有較好的臨床療效。本制劑適用于脾腎兩虛，尤其是氣陰兩虛導(dǎo)致的慢性腎小球腎炎，通過滋養(yǎng)脾腎、潤養(yǎng)脾腎來治療脾腎兩虛之癥。芪丹滋腎顆粒由黃芪、丹參、大黃炭、墨旱蓮、熟地黃、白術(shù)、赤芍、當(dāng)歸、川芎、牡丹皮和炙甘草共十一味藥組成，諸藥合用，共奏益氣補(bǔ)腎、活血化瘀、利水消腫的功效。方中黃芪為君藥，有文獻(xiàn)報(bào)道黃芪甲苷能鎮(zhèn)痛抗氧化、保護(hù)脾腎，能有效降低血壓［1］，通常作為含黃芪復(fù)方中藥制劑的指標(biāo)成分作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考［2］。丹參、大黃炭、墨旱蓮、熟地黃為臣藥，具有抗炎抑菌等作用［3-6］，佐以白術(shù)、赤芍、當(dāng)歸、川芎和牡丹皮，具有抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎等作用［7-11］，炙甘草為使藥，調(diào)和諸藥。諸藥合用共奏滋養(yǎng)脾腎、潤養(yǎng)脾腎之功。

醫(yī)院制劑由所屬醫(yī)院制備并僅于本院臨床使用，沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而制劑品質(zhì)關(guān)系到患者的生命安全和醫(yī)院的正常運(yùn)營［12］，因此建立醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尤為重要。本試驗(yàn)采用TLC法對方中君藥黃芪，臣藥丹參、大黃炭和墨旱蓮進(jìn)行定性鑒別；HPLC-ELSD法對方中的黃芪甲苷進(jìn)行定量測定，建立了芪丹滋腎顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，使其成為安全有效、穩(wěn)定可控的中藥制劑奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 薄層色譜自動(dòng)點(diǎn)樣儀（TLC SAMPLER 4,瑞士），薄層成像系統(tǒng)（REPROSTAR 3,瑞士）；高效液相色譜儀（Agilent 1200,美國）；超聲波清洗器（KQ5200DE,昆山）；電子分析天平（XS205DU,瑞士）；超純水機(jī)（Milli-Q A10,美國）。

1.2 試藥 甲醇（MT）、乙酸乙酯（EAC）、正丁醇（NBA）等分析純試劑購自廣州化學(xué)試劑廠；乙腈（ACN）等色譜純購自德國默克，液相用水為屈臣氏蒸餾水經(jīng)純水機(jī)制得的超純水。

芪丹滋腎顆粒（批號：20190527、20190528、20190529）來源于廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院；黃芪甲苷對照品、黃芪、丹參、墨旱蓮、大黃等對照藥材（批號分別為：110781-201616、120974-201612、120923-201615、120958-201407、121249-201304）均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芪的薄層鑒別 取芪丹滋腎顆粒，研細(xì)，取3 g，加入甲醇30 mL后進(jìn)行30 min超聲處理，濾紙濾過，濾液置水浴鍋蒸干，用水20 mL少量多次將殘?jiān)芙猓簝纱斡盟柡驼〈既芤赫駬u提取，30 mL每次，收集正丁醇液，并用現(xiàn)配的氨試液分2次洗滌，30 mL每次，分取正丁醇液，置水浴蒸干，用1 mL甲醇使溶解，制成芪丹滋腎顆粒黃芪供試品溶液。取黃芪甲苷對照品1 mg，用1 mL甲醇溶解，作為對照品溶液。取黃芪對照藥材1 g，加水50 mL，煮沸，文火保持30 min后快速過濾，濾液自“水液兩次用水飽和正丁醇液振搖提取”起，同法制成黃芪對照藥材溶液。再取已制備的黃芪陰性樣品，同芪丹滋腎顆粒黃芪供試品溶液制備方法制成缺黃芪的陰性對照樣品溶液。參照《中國藥典》2015年版四部通則0502項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，吸取黃芪甲苷對照品溶液、黃芪對照藥材溶液、供試品溶液及陰性對照樣品溶液各2μL，用硅膠G薄層板點(diǎn)樣，展開劑為正丁醇（NBA）-乙酸乙酯（EAC）-稀氨水（1→10）（4∶1∶5）10 ℃以下放置的上層溶液，雙槽展開缸并用氨蒸汽飽和30 min后展開，取出，通風(fēng)廚晾干，用10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色，并用105 ℃加熱至薄層斑點(diǎn)顯色清晰，置365 nm紫外光燈下檢視。在與黃芪甲苷對照品及黃芪對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品有清晰的熒光斑點(diǎn)，并且黃芪陰性對照無干擾。見圖1。

圖1 黃芪薄層色譜圖

2.1.2 丹參的薄層鑒別 取芪丹滋腎顆粒，研細(xì)，取3 g，加入甲醇30 mL后進(jìn)行30 min超聲處理，濾紙濾過，濾液置水浴鍋蒸干，用水20 mL少量多次將殘?jiān)芙?，調(diào)節(jié)pH（稀鹽酸）值至2～3，水液再兩次用乙酸乙酯振搖提取，20 mL每次，收集乙酸乙酯液，置水浴蒸干，用1 mL甲醇使溶解，制成芪丹滋腎顆粒丹參供試品溶液。取丹參對照藥材0.5 g，加水50 mL，煮沸，文火保持30 min后快速過濾，濾液自“調(diào)節(jié)pH（稀鹽酸）值至2～3”起，同法制成丹參對照藥材溶液。再取已制備的丹參陰性樣品，同芪丹滋腎顆粒丹參供試品溶液制備方法制成缺丹參的陰性對照樣品溶液。參照《中國藥典》2015年版四部通則0502項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，吸取丹參對照藥材溶液、供試品溶液及陰性對照樣品溶液各5 μL，用硅膠G薄層板點(diǎn)樣，展開劑為丙酮（DMK）-乙酸乙酯（EAC）-甲酸（FA）（2.5∶1∶0.4），雙槽展開缸并用氨蒸汽飽和5 min后展開，取出，通風(fēng)廚晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。丹參對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品有清晰的熒光斑點(diǎn)，并且丹參陰性對照無干擾。見圖2。

圖2 丹參薄層色譜圖

2.1.3 墨旱蓮、大黃炭的薄層鑒別 取芪丹滋腎顆粒，研細(xì)，取5 g，加入30 mL甲醇后進(jìn)行30 min超聲處理，濾紙濾過，濾液置水浴鍋蒸干，用水20 mL少量多次將殘?jiān)芙?，水液兩次用乙醚振搖提取，20 mL每次，收集乙醚液，通風(fēng)廚揮干，用1 mL甲醇使溶解，制成芪丹滋腎顆粒墨旱蓮、大黃炭供試品溶液。再取墨旱蓮、大黃對照藥材各0.5 g，分別煎煮，各加水50 mL，煮沸，文火保持30 min后快速過濾，濾液自“分兩次用乙醚振搖提取”起，同法分別制成墨旱蓮、大黃對照藥材溶液。再分別取已制備的墨旱蓮、大黃炭的陰性樣品，同芪丹滋腎顆粒墨旱蓮、大黃碳供試品溶液制備方法分別制成缺墨旱蓮、大黃炭的陰性對照樣品溶液。參照《中國藥典》2015年版四部通則0502項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，吸取墨旱蓮、大黃對照藥材溶液、供試品溶液及陰性對照樣品溶液各10 μL，用硅膠G薄層板點(diǎn)樣，展開劑為石油醚I（PE I）-乙酸乙酯（EAC）-甲酸（FA）（9∶1∶0.1），雙槽展開缸展開，取出，通風(fēng)廚晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。墨旱蓮、大黃對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品有明顯相對應(yīng)的黃綠色、橙色熒光斑點(diǎn)，并且墨旱蓮、大黃碳陰性對照無干擾。見圖3。

圖3 墨旱蓮薄層色譜圖

2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.1 黃芪甲苷對照品溶液的制備 精密稱定黃芪甲苷對照品25.50 mg，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.993 48 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液。

2.2.2 芪丹滋腎顆粒供試品溶液的制備 將芪丹滋腎顆粒研細(xì)并過四號篩，取約4 g，置200 mL具塞錐形瓶中，精密稱定，用單標(biāo)移液管加甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)回?fù)p失的質(zhì)量，搖勻，用定量濾紙過濾，再用單標(biāo)移液管量取續(xù)濾液50 mL于蒸發(fā)皿，水浴蒸干，用水20 mL少量多次將殘?jiān)芙?，水液四次用水飽和正丁醇液振搖提取，20 mL每次，收集正丁醇液，用氨試液兩次洗滌，40 mL每次，分取正丁醇液，水浴蒸干，用甲醇少量多次使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶，定容，搖勻，即得。

2.2.3 芪丹滋腎顆粒陰性對照溶液的制備 取已制備的芪丹滋腎顆粒黃芪陰性對照樣品約4 g，置200 mL具塞錐形瓶中，同芪丹滋腎顆粒供試品溶液的制備方法制得黃芪陰性對照溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱為Thermo ODS-2 HypersilTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-水（32∶68）為流動(dòng)相；流速1.0 mL/min；色譜柱溫度25 ℃；氣流1.5 L/min；漂移管溫度45 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.5 陰性干擾試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液、黃芪甲苷對照品溶液（298.044 μg/mL）和缺黃芪陰性對照溶液三種溶液各20 μL，分別注入色譜儀中。結(jié)果顯示，芪丹滋腎顆粒供試品色譜中與黃芪甲苷對照品色譜相同保留時(shí)間均出現(xiàn)色譜峰，而缺黃芪陰性對照品溶液色譜峰與黃芪甲苷對照品色譜峰相同保留時(shí)間內(nèi)未顯示色譜峰，結(jié)果表明該色譜條件下測定黃芪甲苷的含量可靠。見圖4。

圖4 芪丹滋腎顆粒HPLC-ELSD圖譜

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取黃芪甲苷貯備溶液1、2、3、4、5、6 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，得到濃度為每1 mL中分別含黃芪甲苷99.348、198.696、298.044、397.392、496.740、596.088 μg的對照品溶液。分別吸取上述不同濃度的對照品溶液20 μL，進(jìn)行色譜測定，并以峰面積對數(shù)（Y）和進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 1.626 5X+3.809 2（r=0.999 0）；結(jié)果表明黃芪甲苷在1.986 96～11.921 76 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取上述已制備的芪丹滋腎顆粒（批號：20190527）供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)6次進(jìn)樣并進(jìn)行測定，測得峰面積對數(shù)RSD為0.63%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試 驗(yàn)取上述已制備的芪丹滋腎顆粒（批號：20190527）供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定，分別在0、1、2、3、4、5、10、18 h進(jìn)行測定，測得峰面積對數(shù)RSD為0.65%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取芪丹滋腎顆粒（批號：20190527），分別取6份，按照上述供試品溶液制備方法分別制得供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測定，測得峰面積對數(shù)RSD為1.04%，表明所建立的含量測定方法重復(fù)性較好。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 取上述已計(jì)算含量的芪丹滋腎顆粒9份，每份分別精密加入適量的黃芪甲苷對照品，按芪丹滋腎顆粒的制備與測定方法，進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果黃芪甲苷的平均回收率為100.14%。見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率測定結(jié)果（n=9）

2.2.11 含量測定 分別取3批芪丹滋腎顆粒（批號：20190527、20190528、20190529），各平行處理2份，按照芪丹滋腎顆粒供試品溶液制備方法制備，并按上述色譜條件進(jìn)行測定，分別計(jì)算得到每批芪丹滋腎顆粒樣品中黃芪甲苷的含量。見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=2） mg/袋

3 討論

中藥制劑中的藥味鑒別不同于單味藥材鑒別，不少藥味的成分會(huì)相互影響導(dǎo)致陰性干擾，如處方中的赤芍含有芍藥苷，牡丹皮的有效成分也包括芍藥苷［11］，對于這種存在相互干擾的藥味，可以采用雙陰性鑒別；且在制備過程中成分的損失可能導(dǎo)致藥典的薄層鑒別方法在該制劑中未必適用。雖然存在上述問題，薄層鑒別依舊是最經(jīng)濟(jì)、快速、便捷的鑒別方法。本試驗(yàn)對方中各藥味進(jìn)行薄層鑒別方法摸索，建立了方中黃芪、丹參、大黃炭和墨旱蓮4味藥材的薄層鑒別方法并進(jìn)行方法學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)所建立的方法便捷可行，而其余藥味的鑒別有陰性干擾，故未列入標(biāo)準(zhǔn)。

黃芪含有多種三萜皂苷成分，黃芪甲苷為其中之一。有文獻(xiàn)報(bào)道［13］比色法、熒光法、薄層色譜掃描法和液相色譜法常用于測定黃芪中黃芪甲苷的含量。在進(jìn)行比色法測定時(shí)，黃芪甲苷會(huì)受到其他的三萜皂苷的影響，導(dǎo)致測定誤差較大，不能準(zhǔn)確測定含量；而使用熒光法進(jìn)行測定，同樣因?yàn)槿圃碥疹惓煞址倍嗲医Y(jié)構(gòu)類似，分離難度大，易有干擾；薄層色譜掃描法雖然直觀，但是預(yù)處理繁瑣，結(jié)果容易受到外界因素的干擾；而液相色譜法可根據(jù)檢測器類型分成多種方法，如紫外、質(zhì)譜、蒸發(fā)光散射、電噴霧和脈沖安培等檢測器。黃芪甲苷的紫外光譜吸收波長在200 nm左右有最大吸收，但是容易受雜質(zhì)、溶劑和其他三萜皂苷成分干擾，需要進(jìn)行繁雜的預(yù)處理排除干擾，并不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的快捷準(zhǔn)確。本試驗(yàn)采用的HPLC-ELSD法適用于檢測沒有紫外末端吸收的成分，靈敏度高、干擾少，符合質(zhì)量控制的要求。

本研究所建立的質(zhì)量控制方法穩(wěn)定、可靠，重現(xiàn)性好，能較好地對芪丹滋腎顆粒進(jìn)行定性、定量檢測，可用于芪丹滋腎顆粒的質(zhì)量控制。