王小潔， 楊 銳， 蘭 琪， 陳 劉， 劉 潔， 陳中維， 李寧杰*

1. 桂林理工大學(xué)， 廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 桂林 541004；2. 桂林理工大學(xué)， 巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心， 廣西 桂林 541004

微生物絮凝劑(Microbial flocculants，MBF)是一類從微生物體或其代謝產(chǎn)物中提取獲得的一種具有絮凝活性的天然有機(jī)高分子物質(zhì)，其有效成分可為多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或有絮凝能力的菌體[1-8]。微生物絮凝劑與傳統(tǒng)化學(xué)絮凝劑相比，具有生物可降解性、無毒性、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)[9-11]。近年來，研究生物絮凝劑替代有機(jī)合成高分子絮凝劑成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[12]，但目前更多研究關(guān)注的是細(xì)菌中具有產(chǎn)絮凝劑能力的菌株的篩選[13]，真菌產(chǎn)絮菌的相關(guān)研究較少。有課題組前期研究發(fā)現(xiàn)白腐真菌的模式菌種黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)產(chǎn)生的胞外多糖具有絮凝能力，且用量很小[14]，說明該微生物絮凝劑具有進(jìn)一步開發(fā)的意義，然而目前該微生物絮凝劑的產(chǎn)量較少，仍缺少對(duì)其產(chǎn)絮凝條件的優(yōu)化研究。已有研究表明菌種的營(yíng)養(yǎng)條件如碳源、氮源、碳氮比和接種量等會(huì)對(duì)絮凝劑的產(chǎn)量和絮凝效率產(chǎn)生很大影響。馬龍等[15]通過研究一株微生物絮凝劑產(chǎn)生菌株W5的絮凝特性，發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源，酵母粉為氮源時(shí)其生物量及絮凝效率比其他的碳源和氮源的效果更好。錢寶鋼等[16]研究了枯草芽孢桿菌產(chǎn)絮凝劑的最佳發(fā)酵條件，通過研究可知以硫酸銨和尿素為復(fù)合氮源時(shí)對(duì)高嶺土的絮凝效率可達(dá)到98.2%，以蔗糖為碳源時(shí)其絮凝效率可達(dá)98.5%。徐長(zhǎng)繪等[17]從土壤和污泥中篩選出絮凝性能高效且穩(wěn)定的H14菌株，通過對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件等的探索使其產(chǎn)絮凝劑的性能得到優(yōu)化，研究結(jié)果表明以葡萄糖和蛋白胨為最佳碳源和最佳氮源，當(dāng)接種量為9%時(shí)絮凝劑產(chǎn)量最大，并且利用正交實(shí)驗(yàn)得出H14菌株在最佳的培養(yǎng)條件下，其絮凝劑的絮凝效率可達(dá)到91.0%。因此，探究Phanerochaetechrysosporium產(chǎn)絮凝劑的最佳培養(yǎng)條件從而提高絮凝劑的產(chǎn)量并確保絮凝活性，這對(duì)推進(jìn)Phanerochaetechrysosporium產(chǎn)絮凝劑的實(shí)際應(yīng)用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

超細(xì)高嶺土(≤2.5 μm)，葡萄糖、乳糖等，尿素、酵母膏等，氯化鈣、硫酸鎂等，均為分析純。

YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋、ZHJH-C1112C超凈臺(tái)、TS-2102恒溫振蕩培養(yǎng)箱、ZR4-6六聯(lián)攪拌機(jī)、UV-5800PC紫外-可見光分光光度計(jì)，F(xiàn)D-1A-50真空冷凍干燥機(jī)等。

1.2 菌種培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)菌種購(gòu)買自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的PhanerochaetechrysosporiumBKMF-1767 (CCTCC AF96007)，其產(chǎn)絮培養(yǎng)采用微量元素培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO42.000，CaCl20.100，MgSO40.500，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.115，MnSO4·H2O 0.112，ZnSO4·7H2O 0.089，CuSO4·5H2O 0.050，維生素B10.001，酒石酸銨0.206，葡萄糖10.000。將以上藥品溶解于20 mmol/L的酒石酸-酒石酸鈉緩沖液。

高壓滅菌后培養(yǎng)基接種孢子濃度為106個(gè)/mL的孢子懸液，并置于30 ℃，180 r/min培養(yǎng)7 d。

1.3 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

碳源優(yōu)化：葡萄糖分別替換為葡萄糖、葡萄糖和蔗糖1∶1、蔗糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉，接種量為1%；氮源優(yōu)化：酒石酸銨分別替換為NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、尿素、酵母膏，接種量為1%；碳氮比優(yōu)化：使碳源(葡萄糖)固定不變，改變酒石酸銨的量使碳氮比變?yōu)?、8、16、32、50、60、70、80、90、100、110，接種量為1%；接種量?jī)?yōu)化：接種量選擇0.125%、0.25%、0.5%、0.75%、1%和1.5%的孢子懸液，以葡萄糖為碳源，以酒石酸銨為氮源。

1.4 絮凝劑提取及絮凝實(shí)驗(yàn)

絮凝劑的提取方法[14]：高速離心分離得到7 d的培養(yǎng)液，經(jīng)3 500 Da透析5 d，透析后的溶液經(jīng)10 000 r/min離心20 min，所得上清液即為提取的絮凝劑。

絮凝劑濃度測(cè)定方法：前期實(shí)驗(yàn)表明Phanerochaetechrysosporium產(chǎn)生的絮凝劑有效成分是多糖，且多糖是Phanerochaetechrysosporium產(chǎn)生的胞外聚合物中的絕對(duì)主要成分[14]。因此本實(shí)驗(yàn)中絮凝劑的濃度就用多糖濃度表示，多糖濃度使用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定。從培養(yǎng)液中分離得到的菌體，經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干之后稱量剩余菌球的干重測(cè)定生物量。

絮凝實(shí)驗(yàn)在六聯(lián)攪拌器上進(jìn)行，取200 mL的3 g/L的高嶺土溶液，加入1 mg/L的絮凝劑，經(jīng)400 r/min攪拌1 min，40 r/min攪拌3 min，再靜置10 min，取上清液在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A1，以不加絮凝劑為對(duì)照組測(cè)定吸光度A0，絮凝效率=(A1-A0)/A0。每組設(shè)3組平行。

2 結(jié)果與分析

在不同培養(yǎng)基或不同接種量下，微生物生長(zhǎng)情況不一樣，用菌球干重和產(chǎn)生的多糖量來表示其生長(zhǎng)情況。一般認(rèn)為，菌球量和產(chǎn)生多糖量越多，說明該培養(yǎng)條件越適合真菌生長(zhǎng)。而不同條件下Phanerochaetechrysosporium產(chǎn)絮凝劑的絮凝效率也存在差別。

2.1 碳源的影響

從圖1a可知，葡萄糖和淀粉作為碳源時(shí)，Phanerochaetechrysosporium的生物量(菌球干重)及代謝多糖量較高，其中可溶性淀粉為碳源時(shí)的菌球干重為4.35 g/L，代謝多糖為256.80 mg/L，葡萄糖作為碳源時(shí)的菌球干重為2.84 g/L，代謝多糖為281.31 mg/L，淀粉結(jié)構(gòu)為葡萄糖分子聚合而成，則可認(rèn)為，葡萄糖的結(jié)構(gòu)易被Phanerochaetechrysosporium吸收利用；葡萄糖與蔗糖1∶1作為碳源產(chǎn)生的菌球干重為3.17 g/L，比單獨(dú)的葡萄糖要高，但結(jié)合蔗糖單獨(dú)作為碳源時(shí)的產(chǎn)量可推測(cè)導(dǎo)致真菌生物量升高的原因是葡萄糖；乳糖和甘油作為碳源時(shí)真菌生長(zhǎng)量很低，乳糖組幾乎不生長(zhǎng)，甘油組雖產(chǎn)生少量較小的菌球，但基本不代謝產(chǎn)生胞外多糖。從結(jié)果來看，雙糖和甘油難以被真菌吸收利用，葡萄糖或以葡萄糖為單體的淀粉易被真菌生長(zhǎng)利用。

由圖1b可知，以葡萄糖和混合碳源培養(yǎng)產(chǎn)生的絮凝劑絮凝效果都較好，絮凝效率分別為65%和60%；但單獨(dú)用蔗糖培養(yǎng)的則絮凝活性很低，絮凝效率只有10%，用淀粉為碳源產(chǎn)生的絮凝劑絮凝效率為43%，其絮凝效率低于葡萄糖，這一結(jié)果與生物量和多糖產(chǎn)量時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，表明不是所有的微生物多糖都具有絮凝性能，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)條件優(yōu)化的最終目的是尋找最佳的產(chǎn)絮凝劑因素，因此綜合考慮，以葡萄糖作為Phanerochaetechrysosporium產(chǎn)絮凝劑的最佳碳源。

圖1 不同碳源對(duì)真菌生長(zhǎng)、多糖產(chǎn)量及絮凝效率的影響

2.2 氮源的影響

由圖2a可知，與其他的氮源相比以尿素為氮源時(shí)菌球生長(zhǎng)量(菌球干重)最多，達(dá)到5.08 g/L，以硝酸銨為氮源時(shí)產(chǎn)多糖最多，達(dá)到163.61 mg/L；酵母膏為氮源時(shí)真菌的生長(zhǎng)代謝不太穩(wěn)定，而其它幾種銨鹽作為氮源都未獲得較多的多糖。優(yōu)化培養(yǎng)是以獲得更多高絮凝活性的絮凝劑為目的，因此，以硝酸銨為氮源比較適合。由實(shí)驗(yàn)可知氮源對(duì)多糖產(chǎn)量的影響為：硝酸銨>酵母膏>尿素>氯化銨>酒石酸銨>硫酸銨，此前LI等[18]認(rèn)為目前還沒有能夠有效利用無機(jī)氮的微生物產(chǎn)生絮凝劑，而本實(shí)驗(yàn)證明了Phanerochaetechrysosporium可以有效利用硝酸銨等無機(jī)氮源生產(chǎn)絮凝劑。

由圖2b可知，絮凝效果最好的是以硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基產(chǎn)生的絮凝劑，其絮凝效率為82.5%；酵母膏為氮源時(shí)產(chǎn)生的絮凝劑雖然絮凝效率為81.8%，僅低于硝酸銨組，但其產(chǎn)絮凝劑的量較硝酸銨作為氮源時(shí)產(chǎn)絮凝劑的量少33.5%；以尿素為氮源生產(chǎn)的絮凝劑絮凝效率為62.8%，雖然效果不如硝酸銨，但其成本較低；其它幾種銨鹽作為氮源生產(chǎn)的絮凝劑都未獲得太理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，結(jié)合生物量、多糖產(chǎn)生量以及絮凝效率可確定最佳的氮源為硝酸銨。

圖2 不同氮源對(duì)真菌生長(zhǎng)、多糖產(chǎn)量及絮凝效率的影響

2.3 碳氮比的影響

圖3a為在固定葡萄糖濃度為10 g/L時(shí)，不同碳氮比條件下真菌的生長(zhǎng)情況，從圖上可以看出，碳氮比從4～60時(shí)真菌生物量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，而繼續(xù)升高碳氮比，則生物量開始降低。碳氮比低于50時(shí)，絮凝劑的產(chǎn)生受到明顯抑制，從總體來看，高碳氮比相對(duì)于低碳氮比產(chǎn)生多糖量要更多。在一定碳元素下，氮元素過高不利于絮凝劑的產(chǎn)生，而氮元素過低也會(huì)限制真菌代謝多糖。對(duì)于Phanerochaetechrysosporium而言，碳氮比為60～100時(shí)，產(chǎn)生的多糖量為440～540 mg/L，最有利于其產(chǎn)生絮凝劑。

由圖3b可以看出，低碳氮比時(shí)產(chǎn)生的絮凝劑絮凝活性較低，當(dāng)碳氮比在高于50時(shí)，絮凝效率較高，其中以碳氮比為90時(shí)產(chǎn)生的絮凝劑活性最高，其絮凝效率為80.5%，因此可將碳氮比為90作為Phanerochaetechrysosporium產(chǎn)絮凝劑的最佳碳氮比。

圖3 不同碳氮比對(duì)真菌生長(zhǎng)、多糖產(chǎn)量及絮凝效率的影響

2.4 接種量的影響

從圖4a可以看出，接種0.25%～1%孢子懸液時(shí)，真菌生長(zhǎng)量影響不大，都在2.8 g/L左右，但是接種0.125%孢子懸液時(shí)，生物量明顯減少到2.4 g/L，說明需要接種一定的孢子濃度才能使得真菌快速地生長(zhǎng)。接種1.5%孢子懸液時(shí)，真菌生物量開始下降為2.7 g/L，這表明過大或過小的接種量都會(huì)對(duì)微生物絮凝劑的生成造成不利影響，即接種量有一定的范圍，超過這個(gè)范圍，便不利于真菌生長(zhǎng)。有研究表明：過小的接種量會(huì)延長(zhǎng)停滯期，而過大的接種量會(huì)使真菌的生態(tài)位受到極大的干擾，阻礙微生物絮凝劑的合成[12]。多糖的產(chǎn)生量與真菌的生長(zhǎng)量的趨勢(shì)相同，在接種量為1%時(shí)達(dá)到最大(155.57 mg/L)。

圖4 不同接種量對(duì)真菌生長(zhǎng)、多糖產(chǎn)量及絮凝效率的影響

由圖4b可以看出，不同接種量培養(yǎng)下產(chǎn)生的絮凝劑絮凝活性沒有太大差異，可見接種量對(duì)Phanerochaetechrysosporium產(chǎn)絮凝劑沒有太大影響，其中接種1%吸光度為1.000的孢子懸液的絮凝效率最高，其絮凝效率為87.14%，相對(duì)于其他的接種量來說，可以將1%作為最佳的接種量。

3 結(jié)論

碳源、氮源以及碳氮比對(duì)Phanerochaetechrysosporium的生長(zhǎng)和產(chǎn)生絮凝劑的活性影響較大。通過探究可知淀粉作為碳源時(shí)有利于Phanerochaetechrysosporium的生長(zhǎng)，但其產(chǎn)生的絮凝劑的絮凝效率僅為43%，而以葡萄糖作為碳源時(shí)所產(chǎn)生的絮凝劑的絮凝效率為65%，且葡萄糖容易被Phanerochaetechrysosporium吸收利用，因此以葡萄糖作為最佳培養(yǎng)碳源。尿素為氮源時(shí)真菌生物量最高，但產(chǎn)生的絮凝劑的絮凝效率僅為62.8%，而硝酸銨作為氮源產(chǎn)生的絮凝劑的活性最高，其絮凝效率可達(dá)82.5%。碳氮比低于50時(shí)，絮凝劑的產(chǎn)生受到明顯抑制，絮凝劑的產(chǎn)量與活性都較低，而碳氮比過高也會(huì)抑制絮凝劑的產(chǎn)生，最佳產(chǎn)絮凝劑碳氮比為90。接種量對(duì)真菌生長(zhǎng)和絮凝劑的絮凝活性影響較小，由研究結(jié)果可知，最佳接種量為1%，其產(chǎn)生的絮凝劑的絮凝效率為87.14%。綜上所述，最佳營(yíng)養(yǎng)條件是以葡萄糖為碳源，硝酸銨為氮源，碳氮比為90，接種量為1%。通過對(duì)Phanerochaetechrysosporium產(chǎn)絮凝劑的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，可以使Phanerochaetechrysosporium在微生物絮凝劑方面得到較大利用。