食源性致病菌檢測免疫傳感器研究進(jìn)展

2022-03-04 11:23吳有雪吳美嬌田亞晨方水琴

工業(yè)微生物 2022年1期

楊昊，吳有雪，吳美嬌，劉濤，李斌，田亞晨，劉程，方水琴，劉箐

上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093

據(jù)世衛(wèi)組織報(bào)道，每年食源性疾病會導(dǎo)致40多萬人死亡，其中5歲兒童以下死亡病例約占三分一[1]。因此，食品安全已成為全球首要關(guān)注的公共安全衛(wèi)生問題。造成人體食源性疾病的原因有很多，主要包括食品中的病毒、細(xì)菌、寄生蟲、毒素和化學(xué)物質(zhì)等，其中食源性致病菌是主要因素之一。目前，食源性致病菌主要有大腸桿菌O157：H7、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等[2]。1996年，日本爆發(fā)了大腸桿菌O157：H7食品污染事件，造成6000多人感染，并導(dǎo)致2人死亡。2005年，西班牙發(fā)生了預(yù)煮雞沙門氏菌污染事件，導(dǎo)致2000多人死亡[3]。食源性致病菌污染不僅能對人體健康造成危害，還會對社會經(jīng)濟(jì)帶來影響。隨著抗生素的濫用，細(xì)菌耐藥性逐漸變強(qiáng)，從而導(dǎo)致食品安全問題的加重。因此，實(shí)現(xiàn)食源性致病的即時檢測，對預(yù)防食源性致病菌感染，降低由食源性造成的損失至關(guān)重要。

由于傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測方法具有操作繁瑣、耗時長等缺點(diǎn)，無法滿足即時檢測的目的[4]，因此亟需一種快速檢測技術(shù)的建立。免疫傳感器具有檢測過程簡單、便攜、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)食源性致病菌檢測方法中的不足[5]。本文首先簡述了傳統(tǒng)食源性致病菌檢測方法，然后詳細(xì)分析了免疫傳感器各類技術(shù)及其在食源性致病菌檢測的應(yīng)用，以期能夠?yàn)槭吃葱灾虏【鷻z測領(lǐng)域的研究人員提供參考和幫助。

1 傳統(tǒng)檢測技術(shù)

食源性致病傳統(tǒng)檢測方法主要包括分離培養(yǎng)與生化鑒定法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及免疫學(xué)檢測法。分離培養(yǎng)法由于檢測限低、可信度高、操作簡單，是檢測食源性致病菌的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。但該方法需要進(jìn)行微生物的分離培養(yǎng)和多種鑒定實(shí)驗(yàn)，費(fèi)時費(fèi)力。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)是通過檢測目標(biāo)致病菌的特定核酸序列來達(dá)到檢測食源性致病菌的目的。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，檢測時間短等顯著優(yōu)點(diǎn)，但需要依賴專業(yè)的操作人員和昂貴的PCR儀器，使其無法應(yīng)用在低資源地區(qū)[7]。免疫學(xué)檢測方法是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合的方法，主要包括免疫擴(kuò)散、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、膠乳聚集實(shí)驗(yàn)、免疫層析法等[8]。免疫擴(kuò)散是通過抗原抗體在凝膠介質(zhì)中反應(yīng)產(chǎn)生沉淀線來實(shí)現(xiàn)病原體檢測的。該方法靈敏度低，操作繁瑣，在食源性檢測中應(yīng)用較少[9]。ELISA是基于抗原抗體特異性反應(yīng)和高效酶標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的免疫學(xué)檢測方法。該方法雖然縮短了檢測的時間，降低了檢測成本，但靈敏度較低，且易受外界環(huán)境干擾而產(chǎn)生假陽性[10]。免疫層析法是通過帶有標(biāo)記的抗原或抗體在硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)域發(fā)生免疫反應(yīng)后產(chǎn)生可視化顏色的現(xiàn)象來實(shí)現(xiàn)致病菌的檢測。該方法實(shí)現(xiàn)了食源性致病菌的實(shí)時便攜性檢測，將檢測時間縮短至5 min～10 min，但依賴于肉眼進(jìn)行結(jié)果的判讀，檢測靈敏度不高[11]。

2 免疫傳感器技術(shù)

生物傳感器主要包括識別元件、換能器和放大元件三部分。在檢測時，目標(biāo)分析物與識別元件特異性結(jié)合產(chǎn)生生物化學(xué)信號，再利用換能器將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為光、電等可測量的信號，最后通過放大元件實(shí)現(xiàn)信號的放大輸出，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分析物的高靈敏度檢測。根據(jù)識別元件的不同可以將生物傳感器分為免疫傳感器、DNA傳感器、微生物傳感器等(圖1)。免疫傳感器是基于抗原抗體特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)致病菌檢測的，具有特異性強(qiáng)、檢測時間短、靈敏度高等優(yōu)勢。該方法是免疫化學(xué)領(lǐng)域的主要發(fā)展方向，在食源性致病菌檢測中應(yīng)用廣泛[12]。根據(jù)免疫傳感器轉(zhuǎn)化信號的不同，可以將其分為光學(xué)免疫傳感器和電化學(xué)免疫傳感器。

圖1 生物傳感器組成和類型

2.1 光學(xué)免疫傳感器

光學(xué)免疫傳感器是利用光學(xué)材料修飾抗原或抗體，在發(fā)生免疫反應(yīng)時，通過光的散射、折射、反射、吸收將產(chǎn)生的化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號的一種裝置。該方法具有靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目前，常見的光學(xué)免疫傳感器主要包括比色免疫傳感器、熒光免疫傳感器、表面等離子共振免疫傳感器和表面增強(qiáng)拉曼光譜免疫傳感器等。表1總結(jié)概述了各類光學(xué)免疫傳感器在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用。

表1 不同光學(xué)免疫傳感器在食源性致病菌中的應(yīng)用

2.1.1比色免疫生物傳感器

比色法是基于溶液對光的原則性吸收建立的方法。比色免疫生物傳感器通過建立抗原抗體反應(yīng)與比色物質(zhì)顏色變化關(guān)系，以實(shí)現(xiàn)定量檢測的目的，此外這種方法可以通過肉眼觀察從而判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大大提升了檢測的效率。近年來，酶、金納米顆粒(Gold nanoparticle，AuNPs)和二氧化硅納米顆粒廣泛應(yīng)用于比色免疫分析中，提高了檢測靈敏度[20]。

金納米棒(Gold nanorods，GNR)具有被氧化后顯示出顏色改變的特性[21]，基于此，GUO等[22]利用磁性納米粒子與鼠傷寒沙門氏菌抗體偶聯(lián)，通過旋轉(zhuǎn)式磁選機(jī)對靶標(biāo)菌進(jìn)行富集，然后與帶有過氧化氫酶標(biāo)記的抗體偶聯(lián)形成雙抗夾心復(fù)合物催化體系中的H2O2，剩余的H2O2與辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)發(fā)生反應(yīng)生成具有強(qiáng)氧化能力的羥基自由基來蝕刻GNR，通過檢測上清中的吸光度變化，來檢測雞肉樣品中的鼠傷寒沙門氏菌。該方法檢測靈敏度為35 CFU/mL，檢測時間3 h，實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的高靈敏度檢測，但該過程需要經(jīng)過過氧化氫酶催化H2O2和HRP催化H2O2蝕刻GNR兩次反應(yīng)，因此檢測時間較長?；诖耍琕ERDOODT等[13]開發(fā)了一種抗原抗體結(jié)合使AuNPs聚集發(fā)生顏色的改變的方法，來檢測金黃色葡萄球菌。該方法只需通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化羧基，使抗體與AuNPs偶聯(lián)，再加入靶標(biāo)抗原即可實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的檢測。檢測時間縮短至1 min，檢測靈敏度為100 CFU/mL。雖然酶和金納米粒子在免疫傳感器中的使用提高了檢測的靈敏度，但這兩種材料具有操作條件苛刻、價(jià)格昂貴、使用壽命短等缺陷，在實(shí)際應(yīng)用中存在著不足[23]。有研究人員發(fā)現(xiàn)，有色二氧化硅納米顆粒具有合成容易、生產(chǎn)成本低、親水表面大等優(yōu)點(diǎn)[24]，基于此，SHAMS等[25]利用超順磁性納米顆粒和活性藍(lán)二氧化硅納米顆粒分別標(biāo)記靶標(biāo)的多克隆抗體(Polyclonal antibody，PAb)和單克隆抗體(Monoclonal antibody，MAb)形成雙抗體夾心模式來檢測食品中的布魯氏菌。活性藍(lán)二氧化硅納米顆粒被體系中的NaOH溶液蝕刻后，活性藍(lán)染料釋放出來使溶液變藍(lán)。經(jīng)過磁分離操作后測量上清液的染料吸光度，可以定量檢測布魯氏菌。該方法檢測限為450 CFU/mL，實(shí)現(xiàn)了布魯氏菌的高靈敏度檢測，并且該傳感器在120 d內(nèi)性能保持良好，具有較好的穩(wěn)定性。

2.1.2熒光免疫傳感器

熒光免疫傳感器是基于熒光現(xiàn)象，將熒光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體實(shí)現(xiàn)檢測可視化的一類裝置。目前，常用的熒光標(biāo)記物有熒光染料、量子點(diǎn)、熒光金屬納米粒子等。這類熒光物質(zhì)具有較高的光穩(wěn)定性、較強(qiáng)的熒光信號和良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，常作為蛋白標(biāo)記材料廣泛應(yīng)用于免疫傳感器中[26]。

GUO等[27]利用三種有機(jī)熒光染料(7-羥基香豆素、異硫氰酸熒光素和羅丹明)分別標(biāo)記克羅諾桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和大腸桿菌O157：H7，形成有色細(xì)菌，然后通過蛋白G將三種菌的MAb固定在96孔板底部，最后將這三種目標(biāo)菌污染的牛奶樣品和三種有色細(xì)菌依次加入孔中，利用有色細(xì)菌與無熒光菌的競爭，實(shí)現(xiàn)了對三種菌的多重檢測，檢測限為103CFU/mL。本課題組曾利用異硫氰酸熒光染料標(biāo)記大腸桿菌O157：H7和其特異性抗體，用于橫向流動免疫分析中雙標(biāo)記放大信號檢測大腸桿菌O157：H7。固定在結(jié)合墊位置的熒光抗體與樣品墊上的熒光細(xì)菌結(jié)合后層析至檢測線，被檢測線上的另一株大腸桿菌O157：H7抗體所捕獲。對檢測線區(qū)域進(jìn)行紫外激發(fā)光照射后,可以看到明亮的黃色條帶，該方法檢測靈敏度為104CFU/mL，檢測時間縮短至5 min～10 min[28]。此外，量子點(diǎn)的應(yīng)用，開創(chuàng)了食源性致病菌檢測的新方法。DEHGHANI等[29]開發(fā)了一種氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)與石墨烯量子點(diǎn)(Graphene quantum dot，GQD)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法來檢測食品樣品中空腸彎曲桿菌。GQD與抗體偶聯(lián)后，發(fā)生的免疫反應(yīng)導(dǎo)致GO和GQD之間的距離增大，熒光共振能量轉(zhuǎn)移失敗，GQD熒光增強(qiáng)；若溶液中不含有空腸彎曲菌，則GQD與GO通過π-π鍵發(fā)生堆積，產(chǎn)生微弱的熒光現(xiàn)象。該傳感器的檢測限為10 CFU/mL，檢測時間為1.5 h。

2.1.3表面等離子體共振免疫傳感器

表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)是基于一定波長的光與薄金屬表面的電子相互作用后產(chǎn)生強(qiáng)烈共振的現(xiàn)象。其檢測原理為病原體與固定在金屬表面的抗體特異性結(jié)合后，導(dǎo)致金屬表面質(zhì)量增加，從而引起光折射率的改變，產(chǎn)生可測量的信號。表面等離子體共振具有快速、無標(biāo)記、高靈敏度檢測等諸多優(yōu)點(diǎn)。近年來，通過納米粒子、生物親和分子、酶與金屬片表面的結(jié)合，增強(qiáng)了測量信號，提高了檢測靈敏度[30]。FARKA等[31]建立了一種HRP在SPR表面發(fā)生催化反應(yīng)生成沉淀來檢測食品樣品中的鼠傷寒沙門氏菌。發(fā)生免疫反應(yīng)時，HRP催化4-氯-1-萘酚生成不溶性的苯并-4-氯環(huán)己二烯酮，沉淀沉積在SPR表面造成SPR信號的改變。該方法檢測限為104CFU/mL，分析時間為10 min。MASDOR等[32]開發(fā)了一種在金芯片表面生成硫醇自組裝分子膜(Self assembled monolayer，SAM)來定量檢測空腸彎曲菌的方法?？漳c彎曲菌PAb固定在芯片表面用于捕獲目標(biāo)菌，之后與AuNps標(biāo)記的空腸彎曲菌MAb形成雙抗夾心式檢測模式。抗體抗原的結(jié)合導(dǎo)致金芯片表面的光折射率發(fā)生改變，從而引起SPR信號發(fā)生改變。該方法檢出限為4×104CFU/mL。為了增加SPR傳感器表面抗體的有效固定量，TAHERI等[33]利用蛋白G的生物親和性在SPR表面定向固定抗霍亂弧菌重組外膜蛋白抗體，大大提高了霍亂弧菌重組表面抗原與PAb之間的結(jié)合率，檢測靈敏度明顯提高，達(dá)到43 CFU/mL。

2.1.4表面增強(qiáng)拉曼光譜免疫傳感器

拉曼光譜是指一定波長的光與物質(zhì)分子相互作用后，導(dǎo)致光散射頻率改變而產(chǎn)生散射光譜的現(xiàn)象[34]。但這種方法產(chǎn)生的信號比較微弱，限制了其在檢測中的使用[35]。表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface enhancement raman spectroscopy，SERS)是將物質(zhì)固定在金屬或納米粒子表面來增強(qiáng)拉曼散射，其增強(qiáng)效果通?？蛇_(dá)到107～1015倍，因此SERS可用于目標(biāo)分析物單分子層面的超高靈敏度檢測[36]。CHATTOPADHYAY等[37]開發(fā)了一種乙酰乙酰氧基功能化聚合物磁性納米顆粒富集沙門氏菌，利用抗體偶聯(lián)帶有SERS標(biāo)簽修飾的AuNPs來檢測食品中的大腸桿菌。之后通過對免疫復(fù)合物形成過程中產(chǎn)生的拉曼散射強(qiáng)度進(jìn)行掃描，來定量沙門氏菌的濃度。該免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的超高靈敏檢測，檢測靈敏度可達(dá)10 CFU/mL。近幾年，有研究人員發(fā)現(xiàn)中空AuNPs、花狀A(yù)uNPs等具有較高的結(jié)構(gòu)均勻性和光學(xué)特性，可以結(jié)合更多的SERS標(biāo)簽，有效實(shí)現(xiàn)信號的放大[38]?；诖颂匦裕琀WANG等[39]建立了一種拉曼報(bào)告分子標(biāo)記的空心金納米球作為SERS檢測探針的橫向流動免疫分析傳感器，來檢測葡萄球菌腸毒素B。靶標(biāo)抗原與帶有SERS檢測探針的抗體特異性結(jié)合，層析至檢測區(qū)，被檢測區(qū)固定的另一株特異性抗體所捕獲，發(fā)生納米金的聚集而顯色。通過對檢測區(qū)的拉曼信號進(jìn)行測定，實(shí)現(xiàn)了在免疫層析試紙條上的便捷式定量檢測。該方法的檢測靈敏度為0.001 ng/mL，與傳統(tǒng)ELISA檢測方法相比，靈敏度提高了三個數(shù)量級[40]。此外，在檢測體系中引入多種SERS標(biāo)簽，可實(shí)現(xiàn)致病菌的多重檢測。WU等[41]通過5,5′-二硫代雙和4-MBAL兩種拉曼報(bào)告分子標(biāo)記AuNPs分別與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的MAb偶聯(lián)作為信號探針，開發(fā)了一種基于LFA的多重SERS免疫傳感器。該方法檢測范圍為102～107CFU/mL，檢測限為75 CFU/mL，檢測時間低至10 min。

2.2 電化學(xué)免疫傳感器

電化學(xué)免疫傳感器是通過轉(zhuǎn)換器將免疫反應(yīng)中的生物信號轉(zhuǎn)換成電流、電阻、電導(dǎo)等可測量信號的一種裝置，具有靈敏度高、檢測時間短、體型小、成本低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測。電化學(xué)免疫傳感器在致病菌檢測中的檢測性能主要依賴于電極材料以及抗體在電極表面的固定。因此通過在傳感器中引入石墨烯、碳納米管、銦錫氧化物、紙基以及交叉型陣列微電極等多種新型材料，能有效提高病原菌檢測的靈敏度[42]。電化學(xué)免疫傳感器根據(jù)傳導(dǎo)信號可分為電流型、阻抗型、電導(dǎo)型和電化學(xué)發(fā)光四類，表2總結(jié)概述了各類電化學(xué)免疫傳感器在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用。

表2 不同電化學(xué)免疫傳感器在食源性致病菌中的應(yīng)用

2.2.1電流型免疫傳感器

電流型免疫傳感器是基于抗原抗體免疫反應(yīng)造成的電極表面電子轉(zhuǎn)移或者離子聚合物特性的改變，使電流信號發(fā)生改變，通過測量電信號來實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的檢測。SILVA等[49]基于離子聚合物零電流電位測量技術(shù)，將抗體固定在AuNPs聚合物膜表面，實(shí)現(xiàn)了對沙門氏菌的檢測。體系中無靶標(biāo)菌時，聚合物膜的離子通量為穩(wěn)定狀態(tài)，無信號的變化；有靶標(biāo)菌存在時，傳感器表面發(fā)生免疫反應(yīng)阻擋離子的轉(zhuǎn)移，電流信號發(fā)生改變。該電流型免疫傳感器可在1 h內(nèi)檢測低至6 Cells/mL的沙門氏菌。這種方法實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的高靈敏度檢測，但無法對沙門氏菌進(jìn)行定量檢測。ROUSHANI等[50]建立了一種利用抗蛋白A雞IgY抗體作為捕獲抗體，與AuNPs偶聯(lián)后固定在玻碳電極(Glassy carbon electrode，GCE)表面來檢測食品中的金黃色葡萄球菌。抗蛋白A雞IgY抗體能夠特異性的結(jié)合目標(biāo)菌，從而阻礙電極表面電子的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致電流發(fā)生改變。該免疫傳感器的線性范圍為10～107CFU/mL，檢測限為3.3 CFU/mL，與PCR檢測方法相比，靈敏度提高了100倍[51]。HU等[52]利用HRP可以催化氧化態(tài)硫氨酸轉(zhuǎn)化為還原態(tài)硫氨酸的特性，來檢測阪崎腸桿菌。HRP的催化反應(yīng)可以促進(jìn)電極表面電子的轉(zhuǎn)移，當(dāng)電極表面發(fā)生免疫時，阻礙了HRP的活性中心和溶液中的硫氨酸之間的催化反應(yīng)，造成電極的還原峰電流降低。該傳感器檢測線性范圍為102～109CFU/mL，最低檢測限為91 CFU/mL。

2.2.2阻抗型免疫傳感器

阻抗型免疫傳感器是通過對電極溶液施加正弦直流電壓，使電極表面出現(xiàn)交流阻抗，當(dāng)電極表面發(fā)生免疫反應(yīng)時，阻抗信號發(fā)生改變，以此來實(shí)現(xiàn)致病菌的快速檢測。HUANG等[53]為了實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌的檢測，利用戊二醛將抗體固定在牛血清白蛋白偶聯(lián)的3D-銀納米花工作電極表面，免疫反應(yīng)發(fā)生時，電極表面的阻抗發(fā)生改變，以此來檢測食品中的大腸桿菌。這種3D-銀納米花結(jié)構(gòu)具有較大的孔隙率、表面積和良好的導(dǎo)電性，有效提高了電化學(xué)檢測信號，實(shí)現(xiàn)了對檢測限為102CFU/mL大腸桿菌的高靈敏度檢測。雖然Ag、Au等貴金屬納米材料修飾電極，能夠提高了檢測靈敏度，但成本高，且不易合成。為了解決此問題，SOARES等[54]利用激光誘導(dǎo)聚酰亞胺的方法制備了多孔石墨烯作為工作電極，來高靈敏度檢測沙門氏菌。免疫反應(yīng)導(dǎo)致電極表面的阻抗響應(yīng)發(fā)生改變。該傳感器檢測限為6 CFU/mL，檢測時間為22 min，與Au、Ag納米顆粒的固定材料相比，靈敏度更高，而且降低了檢測成本。此外，隨著綠色合成新型材料方法的發(fā)展，以半胱氨酸為模板制備的新一代納米材料也被廣泛應(yīng)用于免疫傳感器中[55]。PANDEY等[56]利用半胱氨酸綠色合成了石墨烯包裹的氧化銅-半胱氨酸結(jié)構(gòu)(rGO-CysCu)，來作為金電極的修飾材料，通過抗體在金電極表面的固定來檢測飲用水樣品中的大腸桿菌O157：H7。由于rGO-CysCu修飾電極具有較高的比表面積和電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)，因此大大提高了電極的穩(wěn)定性和靈敏度，檢測限低至3.8 CFU/mL。

2.2.3電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器

2.2.4電導(dǎo)型免疫傳感器

電導(dǎo)型免疫傳感器是基于電極表面發(fā)生的免疫反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)信號通過導(dǎo)電聚合物的轉(zhuǎn)換作用，將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為可測量的電信號的一種裝置，具有檢測速度快、體型微小等優(yōu)點(diǎn)。在檢測過程中，電極表面的電導(dǎo)率發(fā)生改變，以此來定量檢測目標(biāo)分析物。ICHI等[61]將抗脂多糖蛋白抗體與羧基化的超順磁性納米粒子共價(jià)偶聯(lián)后固定在金交叉薄膜電極表面，當(dāng)抗原抗體結(jié)合時，阻礙了電子的轉(zhuǎn)移，使電解池溶液的電導(dǎo)率降低。該傳感器可用于多種革蘭氏陰性菌的檢測，其中用于大腸桿菌檢測靈敏度為1 CFU/mL。HAN等[62]提出了一種基于單壁碳納米管的微流控場效應(yīng)晶體管免疫傳感器，使用這種傳感器可以檢測磷酸鹽緩沖液中流動的金黃色葡萄球菌。在這個檢測體系中抗體被固定在功能化的碳納米管表面，當(dāng)帶負(fù)電的細(xì)菌流經(jīng)碳納米管時導(dǎo)致電流增大，電導(dǎo)率變大。該傳感器檢測時間為35 min，檢測限為150 CFU/mL。

3 總結(jié)與展望

近幾年，納米粒子等新型材料在免疫傳感器中的應(yīng)用，增加了抗體表面修飾的信號探針數(shù)量，改善了抗體抗原的固定化，提高了檢測靈敏度。除了上述提到的免疫傳感器方法，還有多種新型的免疫傳感器被提出，例如PARK等[63]提出了一種等離子體共振成像免疫傳感器芯片，成功實(shí)現(xiàn)了腸炎沙門氏菌、產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的多靶標(biāo)檢測。該免疫傳感器經(jīng)過菌液富集步驟后，靈敏度可達(dá)到1CFU/mL。而且該功能化的生物芯片可重復(fù)利用，大大降低了檢測成本。集成微流控的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了食源性致病菌的高通量檢測。PARK等[64]采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和側(cè)向流動裝置檢測的集成旋轉(zhuǎn)式微流控系統(tǒng)檢測水或牛奶中的多種致病菌，檢測限為50 CFU/mL。以上免疫傳感器在成本、靈敏度、特異性方面得到了很大的提高，并擺脫了對大型儀器的依賴，但免疫傳感器在實(shí)際應(yīng)用中仍存在以下幾個問題，表3總結(jié)了免疫傳感器在檢測致病菌方面的優(yōu)缺點(diǎn)。

表3 免疫傳感器各技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)

(1) 靈敏性和穩(wěn)定性制約著免疫傳感器的發(fā)展，提高免疫傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性一直是研究人員研究的的熱點(diǎn)。近期，WEI等[65]開發(fā)了一種基于ECL標(biāo)簽N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾和SERS標(biāo)簽羅丹明同時固定Ti3C2Tx MXene 電極材料的ECL/SERS 雙模式免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對創(chuàng)傷弧菌的檢測。ECL的線性范圍為1～108CFU/mL，檢出限為1 CFU/mL；SERS的線性范圍為102～108CFU/mL，檢出限為102CFU/mL。Ti3C2Tx MXene 電極材料具有較大的表面積和傳輸電子的能力，可以使更多的SERS標(biāo)簽和AuNPs負(fù)載在電極表面，極大的提高了檢測靈敏度，同時這種雙模式傳感器得到的兩組結(jié)果可以相互比較，提高結(jié)果的真實(shí)性。因此我們可以將電化學(xué)和光學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，開發(fā)更多新型納米材料和微型電極材料，構(gòu)建雙模式免疫傳感器，提高檢測靈敏度。

(2) 抗體制備比較困難。免疫傳感器主要是基于抗體的特異性識別來實(shí)現(xiàn)抗原的檢測，因此抗體的開發(fā)就顯得極為重要。目前，抗體的制備具有周期長，操作繁瑣，這增加了免疫傳感器的構(gòu)建成本，并且篩選到特異性高的抗體極為困難。由于納米抗體具有分子量小、親和力高、能耐高溫強(qiáng)酸強(qiáng)堿等優(yōu)點(diǎn)，提高了抗體的穩(wěn)定性和特異性，縮短了制備周期。因此我們可以將納米抗體應(yīng)用于免疫傳感器中，來提高傳感器的穩(wěn)定性和使用時間，同時降低傳感器的構(gòu)建成本。