胡麗珠，趙成剛，范俊啟，楊浩然，張尚榮，陳學(xué)冉，方志友

Svil蛋白是Villin/Gelsolin蛋白超家族的一員。目前，哺乳動(dòng)物中已鑒定出5種亞型[1]。研究[2-5]發(fā)現(xiàn)，Svil的主要功能是調(diào)節(jié)微絲骨架與膜的相互作用，調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、分裂、分化，以及偽足的形成等。然而，Svil在胚胎發(fā)育中的作用尚不清楚。

在胚胎發(fā)育的早期階段，細(xì)胞分裂和遷移是最重要的兩大事件。其中，集中延伸運(yùn)動(dòng)(convergence and extension movement， C&E)是原腸期的一個(gè)重要遷移事件[6-7]。Wnt/β-catenin通路在C&E中起著重要作用，其靶基因主要包括bozozok(boz)、chordin(chrd)、dickkopf1 (dkk1)、squint(sqt)，Wnt/β-catenin通路異常會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常[8-9]。該實(shí)驗(yàn)鑒定出斑馬魚中存在的兩個(gè)Svil亞型，其中，Svila與人類Svil1同源性較高，但Svila在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用尚不清楚。該文旨在探究Svila對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響以及對(duì)原腸胚期C&E的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 Svil氨基酸序列同源分析使用Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)軟件，鑒定斑馬魚的兩種Svil亞型，Svila[NP 001030338.2]和Svilb[XP 021323763.1]，與人類的4種Svil1[NP 003165.2]、Svil2[NP 068506.2]、Svil3[NP 001310528.1]、Svil4[NP 001310529.1]，進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，分析種屬間同源性。

1.2 斑馬魚培養(yǎng)和Morpholinos注射將斑馬魚(Danio rerio) AB株置于28.5°C的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)[10-11]。次日清晨產(chǎn)下斑馬魚卵，收集、分類。根據(jù)斑馬魚Svil序列，分別針對(duì)翻譯起始點(diǎn)和外顯子6與內(nèi)含子7之間的剪接序列設(shè)計(jì)反義morpholinos (MO)，序列如下：CAATTCGCTCCTTCCTGTTCATGTC (MOATG，針對(duì)Svila的起始翻譯位點(diǎn))；ATGAAGAGAAGAGCACCCGTGTCT (MOsb，針對(duì)Svila外顯子6與內(nèi)含子7之間的剪接序列)；以及對(duì)照 MO：ATcAAcAGAAcACTCACgCcTGTC (Con MO, 隨機(jī)序列) 。將8 ng MO 注射到斑馬魚胚胎的1～2細(xì)胞期，以敲低斑馬魚胚胎Svila的表達(dá)。

1.3 RT-PCR使用TRIzol提取斑馬魚胚胎背側(cè)組織總RNA，以獲得的RNA為模板，使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(TransGen )進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并獲得cDNA。設(shè)計(jì)SVILa上下游引物，以獲得的cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，將反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得目的基因條帶。Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因RT-PCR步驟同上，檢測(cè)下游靶蛋白mRNA水平，各下游基因引物如表1所示。

表1 基因引物

1.4 原位雜交設(shè)計(jì)地高辛(Digoxin)標(biāo)記的cDNA反義探針。利用正、反向引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增基因片段，將擴(kuò)增得到的片段克隆到pCS2+載體(美國(guó)Invitrogen公司)中，采用NotI線性化，Sp6 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄獲得地高辛標(biāo)記的反義探針。60℃變性，56℃退火。將胚胎固定，在緩沖液中與探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。洗滌、封閉，與抗熒光素堿性磷酸酯酶結(jié)合物保溫1 h，再次洗滌，置于暗處顯色4～24 h，并于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 Western blotWestern blot檢測(cè)β-catenin的核定位情況。利用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(P0027，上海碧云天生物技術(shù)公司)，分別收集胞質(zhì)和胞核中的總蛋白[12]。加入SDS混合均勻，100℃煮樣10 min；SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到NC膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h，PBS洗3次，每次5 min；加入一抗(β-catenin，1：1 000；美國(guó)CST公司， #8480)，4℃過(guò)夜孵育；PBS洗3次，每次5 min，加入HRG標(biāo)記的IgG二抗(1：5 000；美國(guó)CST公司)室溫孵育40 min，洗膜；用ECL化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯色，組蛋白Histon3和β-tubulin分別作為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)參對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚Svil與人源Svil同源性分析斑馬魚含有兩種Svil亞型，分別為Svila和Svilb，人類有五種Svil亞型，分別為Svil1、Svil2、Svil3、Svil4和Svil5。利用Clustal Omega在線工具進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谶M(jìn)化上具有相關(guān)性(圖1)。使用DNAman軟件分析顯示斑馬魚Svila和人類Svil1在序列上具有56.06%的相似性，尤其是斑馬魚Svilaaa270～427與人類Svil1 aa265～411。然而，Svilb和人類Svil1具有32.70%的相似性(圖1)，這表明斑馬魚Svila是人類中Svil1的同源蛋白。

2.2Svila在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式分析使用RT-PCR分別檢測(cè)256細(xì)胞期、胚盾期、尾芽期、體節(jié)期、24 hpf期、36 hpf期、48 hpf期的Svila表達(dá)情況，顯示Svila為母源性表達(dá)，且表達(dá)量隨著早期胚胎發(fā)育的進(jìn)行呈上升趨勢(shì)(圖2A)。利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)斑馬魚胚胎的30%外包期、胚盾期、75%外包期、18 hpf期和36 hpf期Svila的表達(dá)，結(jié)果顯示在斑馬魚胚胎發(fā)育的早期，Svila在整個(gè)胚層均有表達(dá)，而在胚胎發(fā)育后期，Svila主要集中在頭部和體節(jié)處表達(dá)(圖2B)。這些結(jié)果提示Svila可能調(diào)控斑馬魚的早期胚胎發(fā)育。

2.3 斑馬魚Svila敲低胚胎表型分析為了探索Svila在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能，分別注射了MOsb(針對(duì)SvilamRNA剪切)和MOATG(針對(duì)Svila起始翻譯位點(diǎn))敲低斑馬魚中Svila的表達(dá)。與注射對(duì)照MO(Con MO)的胚胎相比，注射MOsb的斑馬魚胚胎在48 hpf階段出現(xiàn)了明顯的體軸彎曲。對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)差為29±1，敲低組標(biāo)準(zhǔn)差為24±6，每組樣本總數(shù)均為30 (圖3B)；注射MOATG的斑馬魚胚胎在48 hpf階段也出現(xiàn)了明顯的體軸彎曲，對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)差為48±2，敲低組標(biāo)準(zhǔn)差為37±13，每組樣本總數(shù)均為50 (圖3C)。暗示Svila基因的敲低可能會(huì)導(dǎo)致斑馬魚胚胎早期原腸胚運(yùn)動(dòng)受阻。

2.4 敲低Svila抑制斑馬魚胚胎集中延伸運(yùn)動(dòng)在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的早期，集中延伸運(yùn)動(dòng)和背腹側(cè)(dorsab-ventral， DV)軸的形成是最重要的兩個(gè)事件。為了探究Svila是否參與了這兩大事件，課題組通過(guò)檢測(cè)30%外包期斑馬魚胚胎腹側(cè)標(biāo)志物Gata2、Eve1和背側(cè)標(biāo)志物Chordin的表達(dá)情況探究Svila對(duì)背腹側(cè)軸形成的影響。與對(duì)照組相比，注射MOsb的胚胎DV軸形成沒(méi)有發(fā)生明顯異常。對(duì)照組3個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)差分別為15±0、15±0、14±1；敲低組3個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)差分別為13±2、13±2、12±3(樣本總數(shù)均為15)。但是，敲低Svila組胚胎頭部和尾部之間的夾角顯著大于對(duì)照組，對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)差為15±0，敲低組標(biāo)準(zhǔn)差為14±1(每組樣本總數(shù)均為15)。這表明Svila的敲低抑制了斑馬魚胚胎的集中延伸運(yùn)動(dòng)。見(jiàn)圖4。

圖1 斑馬魚Svil(Svila和Svilb)與人類4種Svil1(Svil, Svil2, Svil3和Svil4)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

圖2 斑馬魚Svila早期胚胎中表達(dá)模式

圖3 敲低Svila斑馬魚胚胎發(fā)育至48 hpf表型統(tǒng)計(jì)分析

圖4 敲低Svila斑馬魚早期胚胎背腹軸的形成及集中延伸運(yùn)動(dòng)的影響

2.5Svila可能是通過(guò)Wnt/β-catenin通路調(diào)控斑馬魚胚胎發(fā)育為了檢測(cè)Svila是否通過(guò)影響Wnt/β-catenin通路調(diào)控斑馬魚胚胎發(fā)育，進(jìn)行核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)。分別收集胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白，隨后使用Western blot實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Svila敲低后細(xì)胞核中β-catenin含量明顯降低(圖5) (P=0.000 6、0.000 2，F(xiàn)=12.42、7.785)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，敲低Svila組與對(duì)照組相比，β-catenin表達(dá)也下調(diào)(P=0.004 6、0.000 3，F(xiàn)=792.9、345)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間分析結(jié)果顯示對(duì)照組之間P值為1，無(wú)明顯差異；注射MOsb組P=0.000 4，F(xiàn)=233.1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；注射MOATG組P<0.000 1，F(xiàn)=161.9，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，RT-PCR結(jié)果也顯示Svila敲低組中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶蛋白boz、dkk1和sqt的表達(dá)均發(fā)生下調(diào)(圖5C)，boz組P=0.001 2，0.015 0；dkk1組P=0.000 2、0.001 3；sqt組P=0.001 3、0.005 0，chrd組P=0.393 3、0.285 4。綜上所述，Svila主要通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控斑馬魚胚胎的集中延伸運(yùn)動(dòng)。

圖5 敲低Svila將抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路

3 討論

Svil作為細(xì)胞微絲骨架結(jié)合蛋白，通過(guò)與肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，通過(guò)影響其他蛋白的定位和分布調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種活動(dòng)[13]。例如，Svil調(diào)控偽足小體的形成[5]，調(diào)控細(xì)胞存活、細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移等[3-4, 14]。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞分裂、分化和遷移是在不同階段以不同比例發(fā)生的重要事件。在原腸胚期，細(xì)胞的正確定位和各個(gè)組織的正常發(fā)育離不開(kāi)細(xì)胞遷移。

Svil是Gelsolin蛋白家族的一員[1]。據(jù)報(bào)道，這個(gè)家族的其他成員在胚胎發(fā)育的特定階段發(fā)揮著不同的作用。Svil在細(xì)胞水平上的功能研究的較多，但其在胚胎發(fā)育中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明，Svila敲低抑制了斑馬魚胚胎的集中延伸運(yùn)動(dòng)，Svila表達(dá)的下調(diào)會(huì)影響β-catenin在細(xì)胞核上的定位，導(dǎo)致β-catenin的靶基因boz、dkk1、sqt等表達(dá)異常。綜上所述，Svila的敲低降低了細(xì)胞遷移能力，從而阻斷了斑馬魚原腸胚期的集中延伸運(yùn)動(dòng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。