★ 楊佛 楊文龍 李明慧 劉璞 李威 楊智軍 劉江源 羅云豐 楊鳳云（.南昌市洪都中醫(yī)院 南昌 0006；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 0006；.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 0004）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量低、骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞、易發(fā)生骨折為特征的疾病。我國是世界上老年人口絕對(duì)數(shù)最大的國家，隨著人口老齡化的日益加重，骨質(zhì)疏松癥已成為危害老年人健康的重大問題［1］。骨質(zhì)疏松癥具體病因不明，而成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）功能下降及破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）功能亢進(jìn)是導(dǎo)致其發(fā)生的病理機(jī)制。當(dāng)前越來越多研究表明破骨細(xì)胞功能亢進(jìn)是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的重要因素［2］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)加味陽和湯（jiawei yanghe decoction，JWYHD）能增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性［3］，但對(duì)破骨細(xì)胞作用不詳，本研究從破骨細(xì)胞角度研究加味陽和湯對(duì)破骨細(xì)胞的影響，為加味陽和湯治療骨質(zhì)疏松癥提供理論支持。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠65只，體質(zhì)量（200±20）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房內(nèi)，分籠飼養(yǎng)，每籠4只，在相同條件下自由飲水、食用標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 大型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琪，型號(hào)R-220SE）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號(hào)CKX41型）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司，型號(hào)SPARK 10M型）；倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號(hào)IX71型）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 加味陽和湯藥物組成：熟地15 g，肉桂10 g，鹿角膠10 g，麻黃10 g,白芥子10 g,雞血藤20 g，木瓜6 g，炮姜炭6 g，漢防己10 g，甘草3 g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房；RAW264.7細(xì)胞株購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫（批號(hào)A110203481）；Murine M-CSF、MurinesRANK-Ligand（美國Peprotech公司，批號(hào)分別為315-02-10、315-02-10）；CCK8檢測(cè)試劑盒（北京Bioss公司，批號(hào)BA00208）；抗酒石酸酸性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（碧云天公司，批號(hào)P0332）；細(xì)胞核蛋白和漿蛋白抽提試劑盒（碧云天公司;批號(hào)P0028）；p65一抗（Proteintech公司，批號(hào)10745-1-AP-50 μL）；IκB-α一抗（Proteintech公司，批號(hào)10268-1-AP-50 μL）。

2 方法

2.1 加味陽和湯含藥血清的制備 加味陽和湯煎藥時(shí)按生藥量的8倍量（除鹿角膠）加水浸泡30 min，武火煮沸后文火煮40 min，把藥液倒出，再加等量水文火煮40 min，將兩次藥液混合，紗布過濾，將鹿角膠烊化后倒入藥液，用大型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液蒸發(fā)濃縮至每毫升藥液含2 g生藥量,最后高溫封瓶，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?5只SD大鼠隨機(jī)分為加味陽和湯組和生理鹽水組，其中生理鹽水組35只，加味陽和湯組30只。加味陽和湯組予2 g/（kg·d）劑量灌胃，生理鹽水組予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃8 d，末次灌胃2 h后行腹主動(dòng)脈采血，離心取上清，并在56 ℃水浴鍋中滅活，用0.22 μm的一次性濾菌器過濾后放入-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞傳代后按1×105/孔的密度種植在6孔板中，加入含M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）的10% FBS誘導(dǎo)培養(yǎng)，每兩天半量換液，直至鏡下見有大量體積較大的破骨細(xì)胞時(shí)即為誘導(dǎo)成功。

2.3 CCK8法檢測(cè)加味陽和湯血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響 RAW264.7細(xì)胞傳代后按5×103個(gè)/孔的密度種植到96孔板中培養(yǎng)。96孔板分為5組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL的10%FBS，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，5組分別加入20%濃度的生理鹽水血清、5%、10%、20%、40%濃度的加味陽和湯血清干預(yù)培養(yǎng)24 h，24 h后每孔加入10 μL的CCK8溶液，放入37 ℃恒溫孵育箱中孵育2 h，2 h后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm波長處的光密度值，比較含藥血清組與生理鹽水組光密度值是否有差異。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清TRAP值檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞傳代后按1×105個(gè)/孔的密度種植到6孔板中，放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。24 h后更換培養(yǎng)液，其中6孔板分成生理鹽水組、誘導(dǎo)組、加味陽和湯低、中、高劑量組5組，其中生理鹽水組培養(yǎng)液不加誘導(dǎo)因子，其余4組培養(yǎng)液均加含M-CSF（50 ng/mL）和RANKL（100 ng/mL）的血清，放入培養(yǎng)箱中干預(yù)24 h后收集各孔細(xì)胞上清，用抗酒石酸酸性磷酸酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，根據(jù)說明書酶活性定義計(jì)算出各組抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP值。

2.5 Western Blot法檢測(cè)破骨細(xì)胞細(xì)胞核p65蛋白和細(xì)胞質(zhì)IκB-α蛋白表達(dá) RAW264.7細(xì)胞傳代后按1×105個(gè)/孔的密度種植到6孔板中，分為生理鹽水組、誘導(dǎo)組、加味陽和湯低、中、高劑量組5組，每孔加入2 mL的10% FBS，放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。24 h后更換培養(yǎng)液，生理鹽水組加入20%生理鹽水血清，其余4組均加入含M-CSF（50 ng/ml）、RANKL（100 ng/ml）、加味陽和湯的血清，放入培養(yǎng)箱中干預(yù)培養(yǎng)24 h，24 h后取出6孔板，用細(xì)胞核蛋白和漿蛋白抽提試劑盒分別提取破骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白。BCA試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度并定量，將蛋白變性后依據(jù)等體積上樣原則上樣，再依次經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗、洗一抗、孵二抗、洗二抗步驟，最后在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行曝光，并進(jìn)行條帶分析，計(jì)算目的蛋白/內(nèi)參蛋白比值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠灌胃情況及含藥血清制備情況 灌胃前后大鼠精神狀態(tài)均良好，灌胃過程因誤入大鼠氣管導(dǎo)致死亡2只，均為加味陽和湯組。制備含藥血清時(shí)因采血針刺穿血管導(dǎo)致采血失敗6只，2只為加味陽和湯組，4只為生理鹽水組。

3.2 加味陽和湯血清對(duì)細(xì)胞活性的影響 加味陽和湯血清濃度為5%、10%、20%時(shí)，與生理鹽水組比光密度值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)其濃度為40%時(shí)，其光密度值與生理鹽水組比下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 加味陽和湯血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性及干預(yù)破骨細(xì)胞后上清TRAP活力值的影響（±s）

表1 加味陽和湯血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性及干預(yù)破骨細(xì)胞后上清TRAP活力值的影響（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05；與誘導(dǎo)組比較，**P＜0.01。

?

3.3 各組細(xì)胞上清液TRAP活力值 與誘導(dǎo)組比，加味陽和湯血清組TRAP活力值降低，隨著干預(yù)濃度的提高，TRAP值降低越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

3.4 加味陽和湯血清對(duì)破骨細(xì)胞細(xì)胞核p65、細(xì)胞質(zhì)IκB-α蛋白表達(dá)的影響 與生理鹽水組比較，誘導(dǎo)組p65蛋白表達(dá)增加；與誘導(dǎo)組比，加味陽和湯血清干預(yù)組p65表達(dá)降低，且濃度越高，p65蛋白表達(dá)越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與生理鹽水組比，誘導(dǎo)組IκB-α蛋白表達(dá)降低；與誘導(dǎo)組比，加味陽和湯血清干預(yù)組IκB-α蛋白表達(dá)增加，且藥物濃度越高，IκB-α蛋白表達(dá)越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2和圖1。

表2 味陽和湯血清對(duì)細(xì)胞核p65、細(xì)胞質(zhì)IκB-α蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 味陽和湯血清對(duì)細(xì)胞核p65、細(xì)胞質(zhì)IκB-α蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與誘導(dǎo)組比較，**P＜0.01。

?

圖1 破骨細(xì)胞細(xì)胞核p65、細(xì)胞質(zhì)IκB-α蛋白表達(dá)

4 討論

骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)學(xué)“骨枯”“骨痿”“骨極”范疇，其發(fā)生主要與肝脾腎三臟功能失常關(guān)系密切［4-5］。中醫(yī)認(rèn)為，脾為后天之本，氣血生化之源，其運(yùn)化水谷精微以濡養(yǎng)軀體，脾運(yùn)化功能失常，則會(huì)導(dǎo)致肌肉萎縮，骨骼失養(yǎng)，導(dǎo)致骨痿；肝藏血主筋，腎藏精主骨，肝腎功能正常，則骨生長發(fā)育正常，肝腎功能異常，則會(huì)導(dǎo)致骨痿［6］。肝血虛則筋脈失養(yǎng)，肢體屈伸不利，氣血不足會(huì)導(dǎo)致血液運(yùn)行遲緩而成瘀血，導(dǎo)致骨失濡養(yǎng)，而腎精虧虛導(dǎo)致骨骼失養(yǎng)，最終導(dǎo)致骨痿。因此，骨痿的病因病機(jī)是肝腎虧虛、血瘀［7］，其治療原則是補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、活血化瘀［8］。

陽和湯出自清代王維德的《外科證治全生集》，主治陽虛寒凝之貼骨疽、脫疽、流注等疾病。方中鹿角膠溫腎陽、益精血、壯筋骨，炮姜、肉桂溫陽散寒，熟地滋陰養(yǎng)血、填精補(bǔ)髓，白芥子溫陽通絡(luò)，麻黃宣通經(jīng)絡(luò)，全方共奏溫腎陽、補(bǔ)氣血、散寒通滯之功。

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院許鴻照名老中醫(yī)在陽和湯原方基礎(chǔ)上加雞血藤、木瓜、防己組成加味陽和湯在臨床上治療膝骨性關(guān)節(jié)炎，取得了良好的療效，相關(guān)的臨床研究也證實(shí)了其可以延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變［9-10］。楊鳳云教授根據(jù)骨質(zhì)疏松癥患者與膝骨性關(guān)節(jié)炎患者病因病機(jī)相似之處，在臨床上運(yùn)用該方治療骨質(zhì)疏松癥，獲得了理想的療效。

現(xiàn)代研究也表明加味陽和湯能治療骨質(zhì)疏松癥，如劉文源［11］運(yùn)用陽和湯治療60例骨質(zhì)疏松患者，有效率達(dá)93.85%；陳墨川等［12］運(yùn)用加味陽和湯治療49例骨質(zhì)疏松腎陽虛患者，有效率達(dá)87.76%。且研究表明加味陽和湯中鹿角膠能抑制骨吸收、延緩骨丟失和溶解的作用［13］，熟地具有抗疲勞和強(qiáng)壯的作用［14］。

在本研究中，CCK8法顯示5%、10%、20%濃度的加味陽和湯血清對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響，而40%濃度的血清明顯抑制細(xì)胞活性，說明40%濃度的含藥血清可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因此在本實(shí)驗(yàn)中選用5%、10%、20%作為實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度。

抗酒石酸酸性磷酸酶是酸性磷酸酶的6種同工酶中的一種，是破骨細(xì)胞的特征性酶［15-16］。破骨細(xì)胞會(huì)分泌抗酒石酸酸性磷酸酶［17］，因此在誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成OC時(shí)，可檢測(cè)RAW264.7組各組細(xì)胞上清中抗酒石酸酸性磷酸酶的TRAP值來驗(yàn)證加味陽和湯對(duì)OC的作用，通過本研究也說明加味陽和湯能抑制OC的形成。

NF-κB信號(hào)通路是OC形成過程中一條重要的信號(hào)通路。在靜息條件下，NF-κB與其抑制性蛋白組成三聚體呈非活性狀態(tài)［18］，當(dāng)RAW264.7細(xì)胞加入M-CSF和RANKL誘導(dǎo)后，會(huì)激活NF-κB信號(hào)通路，使IκB-α發(fā)生解離，核心蛋白p65蛋白由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中［19-20］。

本研究通過WB法檢測(cè)各組細(xì)胞核p65蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組細(xì)胞核p65蛋白表達(dá)顯著增加，表明RAW264.7細(xì)胞經(jīng)M-CSF和RANKL誘導(dǎo)后，NF-κB信號(hào)通路被激活，p65進(jìn)入細(xì)胞核，而加味陽和湯組p65蛋白表達(dá)下降，表明加味陽和湯能抑制p65因子的入核。誘導(dǎo)組細(xì)胞質(zhì)IκB-α蛋白表達(dá)降低，表明加入誘導(dǎo)因子刺激后IκB-α蛋白發(fā)生了磷酸化，蛋白發(fā)生降解，而含藥血清組IκB-α蛋白表達(dá)增加，說明加味陽和湯能抑制IκB-α蛋白的磷酸化，通過兩方面說明了加味陽和湯能抑制NF-κB信號(hào)通路。

因此，本實(shí)驗(yàn)表明5%、10%、20%濃度的加味陽和湯不抑制RAW264.7細(xì)胞活性；加味陽和湯能抑制NF-κB的激活，抑制p65的入核和IκB-α的磷酸化，各組之間存在劑量依賴性，20%濃度的加味陽和湯血清抑制效果最強(qiáng)。