余 利，蔣 玲，周 杰，候鵬飛，糜漫天，易 龍

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍隊營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室/重慶市醫(yī)學(xué)營養(yǎng)研究中心/重慶市營養(yǎng)與食品安全重點實驗室，重慶 400038)

腸黏膜免疫組織是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。腸腔中大量的食物抗原、代謝產(chǎn)物、微生物等給腸黏膜中的各種免疫細胞提供了非常特殊的微環(huán)境，免疫細胞與微生物相互共進化而達到平衡。當這種平衡被破壞時，往往會發(fā)生炎癥或感染。腸黏膜上皮及固有層中有許多不同種類的免疫細胞，固有淋巴樣細胞(innate lymphoid cells，ILCs)是一類新近定義的細胞家族，在快速啟動早期免疫反應(yīng)限制病原體入侵、促進組織修復(fù)以及調(diào)節(jié)抗原特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。ILCs是一類異質(zhì)性免疫細胞群，屬淋巴細胞家族成員，由共同淋巴祖細胞(common lymphoid progenitor，CLP)分化而成，其既不屬于傳統(tǒng)的T細胞、B細胞，也缺乏抗原特異性受體TCR和BCR，但卻能介導(dǎo)獲得性免疫相關(guān)功能，因此成為了固有免疫與獲得性免疫之間的“橋梁”。根據(jù)細胞表型、分泌細胞因子及其分化所依賴的不同轉(zhuǎn)錄因子，ILCs可分為1型固有淋巴樣細胞(group 1 innate lymphoid cells，ILC1)、2型固有淋巴樣細胞(group 2 innate lymphoid cells，ILC2)、3型固有淋巴樣細胞(group 3 innate lymphoid cells，ILC3)和調(diào)節(jié)型固有淋巴樣細胞(regulatory innate lymphoid cells，ILCreg)四類。其中，ILC3主要分布在腸黏膜固有層中，在維持腸道穩(wěn)態(tài)、抵御外界病原體、維護腸道屏障功能方面具有重要作用[1-4]，與2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病等慢性疾病及炎癥性結(jié)腸炎等的發(fā)生密切相關(guān)[5-6]，因此其成為了近年來免疫學(xué)領(lǐng)域研究的新熱點。但是，腸黏膜固有層ILC3的檢測和分析存在較多技術(shù)難點，本研究在借鑒國內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，針對小鼠小腸和結(jié)腸組織消化、固有層淋巴細胞多標記物共標和流式細胞術(shù)檢測、ILC3的IL-22表達分析等環(huán)節(jié)，建立了一套成熟可行的檢測和分析方法，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性C57BL/6小鼠10只，體質(zhì)量20～25 g，購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，普通飼料常規(guī)喂養(yǎng)，實驗前12 h禁食。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)購自中杉金橋公司；Hanks和D-Hanks平衡鹽溶液購自碧云天生物公司；小鼠重組IL-23蛋白購自R&D Systems公司；β-巰基乙醇購自Sigma-Aldrich公司；布雷非德菌素A和莫能霉素購自BD Bioscience公司；青霉素/鏈霉素(penicillin-streptomycin，P/S)混合溶液購自碧云天生物公司；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonicacid，HEPES)和DNA聚合酶Ⅰ(DNase Ⅰ)購自上海生工生物公司；Percoll密度梯度離心分離液購自美國GE Healthcare公司；膠原酶D和分散酶購自瑞士Roche公司；固定/破膜試劑盒購自美國BD Bioscience公司、foxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色試劑盒購自美國eBioscience公司；大鼠抗小鼠CD45 APC-CY7、CD3 FITC、CD90.2 PE-CY7、RORγt PE及IL-22 PerCP eFluor710均購自美國BD Bioscience公司，以上抗體工作濃度均為1∶100。

1.2 主要儀器

流式細胞儀(BD FCSverse，BD Biosciences公司，美國)、高速低溫離心機(Beckman Coulter，德國)、臺式低速水平離心機(L530，Cence湘儀離心機儀器有限公司，中國)、THZ-C恒溫振蕩器(江蘇太倉實驗設(shè)備廠，中國)、電子天平(METTLER TOLEDO，瑞士)。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑配制 小腸預(yù)消化液：D-Hanks平衡鹽溶液中加入1 mmol/L DTT、5 mmol/L EDTA、10 mmol/L HEPES、5%FBS，充分混勻，以0.22 μm過濾器過濾后置于37 ℃孵箱中備用，每只小鼠需要約20 mL。小腸消化液：Hanks平衡鹽溶液中加入0.5 mg/mLⅡ型膠原酶、100 μg/mL DNase Ⅰ、10% FBS，充分混勻，以0.22 μm 過濾器過濾后置于37 ℃孵箱中備用，每只小鼠需要約10 mL。小腸密度梯度離心液：首先配制含2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，用該溶液和Percoll密度梯度離心分離液混合制成30% Percoll工作液，置于室溫備用，每只小鼠需要約10 mL。結(jié)腸預(yù)消化液：D-Hanks平衡鹽溶液中分別加入10 mmol/L HEPES和5 mmol/L EDTA，充分混勻，每只小鼠需要約10 mL。結(jié)腸消化液：Hanks平衡鹽溶液中分別加入500 μg/mL膠原酶D、500 μg/mL DNase Ⅰ、0.5 U/mL分散酶和2%FBS，充分混勻，每只小鼠需要約15 mL。Percoll工作液：首先用10×PBS與Percoll密度梯度離心分離液按照1∶9的體積比混合，制備100% Percoll，再與1×PBS按不同的體積比混合可得到不同濃度的Percoll工作液。IL-22檢測細胞刺激培養(yǎng)液：在RPMI 1640培養(yǎng)基中分別加入50 ng/mL IL-23、55 nmol/L β-巰基乙醇、20% FBS、2%青霉素—鏈霉素溶液、布雷非德菌素A(1∶1 000)和莫能霉素(1∶1 500)，充分混勻。

1.3.2 小腸及結(jié)腸組織分離和前處理 腸組織分離：小鼠用5%水合氯醛麻醉后固定在手術(shù)板上，用75%乙醇消毒腹部，“工”形打開腹膜，剪開小腸與胃結(jié)合部，用鑷子游離小鼠腸道組織，從回盲部完全分離小腸，切除盲腸后，在近直腸處完全分離結(jié)腸組織。腸組織前處理：將小腸和結(jié)腸組織分別置于4 ℃預(yù)冷的PBS中，去除腸系膜、脂肪組織和小腸Peyer’s淋巴結(jié)(可通過其不透明的顏色和節(jié)點結(jié)構(gòu)來識別)，沿腸道長軸剪開腸組織，在預(yù)冷的PBS中洗滌2次，除去糞便和黏液。

1.3.3 小腸和結(jié)腸固有層淋巴細胞分離 小腸固有層淋巴細胞分離：將小腸轉(zhuǎn)入50 mL無菌EP管中，每管加入20 mL小腸預(yù)消化液，37 ℃、210 r/min震蕩20 min，連續(xù)消化2次，渦旋后棄上清。用Hanks平衡鹽溶液漂洗組織2次，加入10 mL小腸消化液，37 ℃、210 r/min震蕩30 min，連續(xù)消化3次，收集每次的消化液，用70 μm細胞篩過濾到50 mL無菌EP管中，4 ℃、2 000 r/min離心10 min，重懸并合并細胞沉淀。每個樣本用10 mL 30% Percoll工作液，2 000 r/min離心10 min，棄上清，保留細胞沉淀，1×PBS洗滌1次，用含20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞。結(jié)腸固有層淋巴細胞分離：將結(jié)腸轉(zhuǎn)入50 mL無菌EP管中，每管加入5 mL結(jié)腸預(yù)消化液，37 ℃、180 r/min震蕩20 min，重復(fù)2次，渦旋后棄上清。立即將結(jié)腸轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的PBS中清洗，隨后置于紙巾上輕拍，再用剪刀將結(jié)腸剪碎成約4 mm×4 mm的小塊，然后轉(zhuǎn)移到裝有5 mL結(jié)腸消化液的50 mL無菌EP管中，37 ℃、210 r/min震蕩20 min，重復(fù)消化3次，收集每次的消化液，用70 μm的細胞篩過濾到50 mL無菌EP管中，加入5 mL含2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，混勻后4 ℃、800×g離心10 min。每個樣本用7 mL含2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸沉淀，加入3 mL 的100% Percoll工作液，渦旋15 s，充分混勻，1 300×g離心20 min，1×PBS洗滌1次，用含20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞。

1.3.4 ILC3染色和流式細胞術(shù)檢測 取分離后的腸黏膜固有層淋巴細胞，加入PBS(1 mL/1.5 mL EP管)，混勻洗滌1次后，500×g離心5 min。棄上清，余約100 μL液體，渦旋細胞。加入流式檢測表面抗體CD45 APC-CY7、CD3 FITC和CD90.2 PE-CY7各1 μL，4 ℃避光孵育30 min。加入1 mL PBS，混勻洗滌1次，500×g離心5 min，棄上清。加入1 mL 轉(zhuǎn)錄因子1×固定/破膜工作液，渦旋細胞，室溫避光孵育30 min。700×g離心5 min，再加入1 mL的1×固定/破膜緩沖液，洗滌1次。以700×g離心5 min，余約100 μL液體，加入1 μL RORγt PE抗體，混勻，室溫避光孵育30 min。加入PBS(1 mL/1.5 mL EP管)，混勻洗滌，700×g離心5 min。棄上清，用300 μL PBS重懸細胞，隨后上機檢測，利用FlowJo(10.0版本)軟件分析。

1.3.5 ILC3表達IL-22的檢測 取分離后的腸黏膜固有層淋巴細胞，用新鮮配制的IL-22檢測細胞刺激培養(yǎng)液重懸后，加入到24孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中刺激和孵育4 h，隨后收集細胞進行染色，細胞固定/破膜后同時加入IL-22 PerCP eFluor710抗體，其余步驟同1.3.4，隨后上機檢測，利用FlowJo(10.0版本)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠小腸和結(jié)腸固有層淋巴細胞分離

小腸和結(jié)腸ILC3的檢測首先要獲取小腸和結(jié)腸固有層淋巴細胞單細胞懸液，分離步驟見圖1，總分離時間約3 h。

2.2 小鼠小腸和結(jié)腸固有層ILC3及IL-22表達檢測

本研究采用CD45+CD3-CD90.2+RORγt+多標記物共標的流式分析策略檢測小腸和結(jié)腸ILC3(圖2a)，同時固有層淋巴細胞分離后體外刺激4 h，利用胞內(nèi)流式細胞術(shù)進一步檢測ILC3表達IL-22的水平(圖2b)，結(jié)果顯示，在小腸和結(jié)腸中，ILC3在淋巴細胞中的占比分別為(8.30±2.42)%和(1.43±0.34)%，IL-22+ILC3在RORγt+ILC3中的占比分別為(38.98±8.76)%和(85.86±1.72)%，見圖2c、d。

a：打開小鼠腹腔；b：分離小腸和結(jié)腸組織；c：去除腸系膜和脂肪組織；d：去除小腸和結(jié)腸內(nèi)容物；e：待消化的小腸和結(jié)腸；f：將分離干凈的小腸和結(jié)腸組織置于預(yù)冷的PBS中；g：分別加入小腸和結(jié)腸預(yù)消化液；h：于37 ℃搖床中消化；i、j：將組織用Hanks平衡鹽溶液洗滌后加入消化液；k：過濾消化液；l：Percoll工作液純化細胞

a：小腸和結(jié)腸固有層ILC3檢測；b：胞內(nèi)流式細胞術(shù)檢測ILC3表達IL-22的水平;c、d：小腸和結(jié)腸固有層ILC3比例及IL-22表達水平

3 討論

免疫學(xué)的發(fā)展讓我們逐漸認識到，疾病高發(fā)組織器官(如肝、腸、肺、腦等)由于具有獨特的結(jié)構(gòu)、功能和組織微環(huán)境，形成了獨特的區(qū)域免疫特性，一些重要免疫細胞群、免疫分子在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[7-8]。腸道既是機體吸收營養(yǎng)的主要器官，也是機體最大的黏膜免疫器官，是抵御病原體入侵的重要防線，腸道屏障對維持腸道局部及機體的穩(wěn)態(tài)有著重要作用。ILCs是機體固有免疫的重要組成部分，在啟動早期反應(yīng)清除病原體入侵和感染、黏膜穩(wěn)態(tài)維持、組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。ILCs的四個亞型ILC1、ILC2、ILC3和ILCreg[9]分別與輔助性T細胞1(Th1)、輔助性T細胞2(Th2)、輔助性T細胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)互為“鏡像細胞”。其中，ILC3幾乎全部分布于胃腸黏膜固有層中，是維持腸黏膜固有免疫及屏障功能的關(guān)鍵效應(yīng)細胞。

腸道穩(wěn)態(tài)是腸黏膜屏障、腸道菌群、營養(yǎng)代謝物質(zhì)等相互作用形成的動態(tài)平衡狀態(tài)[10]。作為在生理狀態(tài)下腸黏膜組織中分布較廣泛的ILCs亞群，ILC3主要通過分泌IL-22、IL-17、GM-CSF等細胞因子對抗致病菌，誘導(dǎo)機體對共生菌群及食物抗原的免疫耐受，并促進腸黏膜損傷修復(fù)，從而維持腸道穩(wěn)態(tài)。IL-22是ILC3分泌的主要效應(yīng)細胞因子，屬于IL-10家族，主要由NCR+ILC3分泌，在穩(wěn)態(tài)下可被黏附于腸上皮的共生菌群誘導(dǎo)產(chǎn)生，是維持腸道穩(wěn)態(tài)的重要細胞因子。ILC3能夠產(chǎn)生IL-22作用于腸上皮細胞的異二聚體受體IL-22R1、IL-22R2，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2信號通路，使其分泌Muc1、Muc3、Muc10和Muc13等黏蛋白及RegⅢβ、RegⅢγ等抗菌肽以對抗致病菌，限制共生菌與上皮細胞的接觸，避免產(chǎn)生腸道炎癥[11]。此外，ILC3還可以通過分泌IL-17發(fā)揮促炎作用，誘導(dǎo)炎癥性腸病的發(fā)生[12]。因此，ILC3與腸道屏障功能、多種腸道相關(guān)疾病的發(fā)生密切相關(guān)。ILC3以表達轉(zhuǎn)錄因子RORγt為特征，RORγt與ILC3的存活、分化和免疫功能密切相關(guān)，能夠通過ROR反應(yīng)元件介導(dǎo)IL-22表達。

原代分離腸ILCs及檢測ILC3的數(shù)量和功能對于開展實驗研究十分重要，但是腸ILCs的分離和ILC3的檢測存在一些技術(shù)難點，且國內(nèi)外不同實驗室在方法上亦不統(tǒng)一。首先，小鼠腸黏膜固有層存在大量膠原纖維，且小腸和結(jié)腸組織中膠原纖維種類差異較大，因此選擇合適的膠原酶進行消化是關(guān)鍵；其次，分離時間的長短與細胞活力密切相關(guān)，因此探索最優(yōu)化的分離方法，縮短分離時間尤為關(guān)鍵；此外，由于ILC3的檢測需采用多個標記物共標并通過多色流式細胞術(shù)進行，但既往ILC3細胞表面標志物和分析策略在國際上尚未完全統(tǒng)一，因此探索公認且便捷的表面標志物至關(guān)重要。

目前，關(guān)于腸ILCs的分離和ILC3的檢測，國內(nèi)外多個實驗室先后建立了一些初步方法，但不同實驗方法都存在一定局限性，且不同實驗室之間的方法也存在一定差異。本實驗室結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究，進一步探索和優(yōu)化了ILCs分離和ILC3檢測的實驗條件，取得了較好的效果。本研究主要的技術(shù)特點和創(chuàng)新包括以下三個方面：①建立了有效去除腸系膜淋巴組織、Peyer’s淋巴結(jié)及腸上皮間淋巴細胞的方法，可避免其對固有層淋巴細胞的干擾。先機械分離腸系膜和脂肪組織，再識別小腸組織的Peyer’s淋巴結(jié)并予以去除，最后利用EDTA-DTT法將上皮層與固有層充分分離，實驗結(jié)果提示，該方法基本排除了腸道其他淋巴細胞的影響，保證了固有層淋巴細胞的純度。②建立了分別針對小腸和結(jié)腸膠原纖維的消化方法。對于小腸組織，本研究利用0.5 mg/mL Ⅱ型膠原酶消化3次的方法。由于Ⅱ型膠原酶含有更高的梭菌蛋白酶活性，有利于水解小腸固有層組織中具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維，可充分分離小腸固有層淋巴細胞，同時加入100 μg/mL DNase I，可防止細胞死亡后釋放大量的DNA導(dǎo)致細胞粘連，從而有效地分離出固有層單細胞懸液。對于結(jié)腸組織，本研究采用500 μg/mL膠原酶D和0.5 U/mL分散酶進行消化。膠原酶D有較低的膠原酶活性和極低的胰蛋白酶活性，能在水解膠原纖維的同時最大程度地保護細胞蛋白的完整性。分散酶也稱中性蛋白酶，是一種非特異性的金屬蛋白酶，可以有效水解Ⅳ型膠原纖維和纖連蛋白，適合結(jié)腸組織固有層淋巴細胞的消化分離，加入適量的DNase I后同樣也可防止細胞粘連，從而有效地分離出固有層淋巴細胞單細胞懸液。但是，針對不同研究目的、實驗動物和干預(yù)因素，不同實驗中所采用的消化酶存在很大差異，如Wang等[13]在分離腸道固有層ILCs時選用的是Ⅱ型和Ⅲ型膠原酶，Chun等[14]則是采用膠原酶D消化分離結(jié)腸固有層ILCs，而在Dutton等[15]、Melo-Gonzalez等[16]和Zhou等[17]的研究中均采用Ⅷ型膠原酶進行小腸ILCs的消化分離。本研究所建立的方法適用于24周(6月齡)的C57BL/6小鼠，該年齡的小鼠腸道結(jié)締組織較多，消化較困難。因此，根據(jù)不同情況選擇合適的膠原酶以及消化時間，能夠有效分離更多數(shù)量和有活性的ILCs。③建立了基于多種標志物的ILC3流式細胞術(shù)檢測方法。ILC3自發(fā)現(xiàn)以來，其檢測標志物隨著認識的不斷深入和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展而不斷變化，如CD45+Lin-CD127+RORγt+、CD45+Lineage-Thy1+RORγt+、CD45+Lin-CD127+CD90+RORγt+Tbet+/-等[18]。由于RORγt為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，無法實現(xiàn)活細胞染色。近年來隨著研究發(fā)展，為了實現(xiàn)ILC3的分選，CD45lowThy1.2high、CD45+Lin-CD90.2+NK1.1-NKp46+/-KLRG1-等分選策略也相繼被公認，其中固有淋巴細胞為輔助性T細胞的鏡像細胞，因此也常用CD3-代替Lineage-的標志物對ILC3進行標記[19]。本研究采用流式分析策略檢測小腸和結(jié)腸ILC3，結(jié)果顯示，此方法可成功分離小腸和結(jié)腸中的ILC3細胞，且小腸中ILC3細胞數(shù)比結(jié)腸中多，與國外同類研究基本一致[20-22]。

綜上，本研究建立了一種小腸和結(jié)腸固有層ILC3檢測和分析的方法，應(yīng)用不同消化液分別消化小腸和結(jié)腸固有層淋巴細胞，進而通過多色流式細胞術(shù)檢測ILC3及IL-22的表達，方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性較好，為研究小腸和結(jié)腸ILC3打下了良好的基礎(chǔ)。此外，由于腸黏膜固有層中還存在大量其他淋巴細胞亞群，本研究所建立的腸黏膜固有層淋巴細胞分離和ILC3的檢測方法，也可為腸黏膜其他淋巴細胞如腸上皮間淋巴細胞、固有層T淋巴細胞、B淋巴細胞等的檢測分析提供借鑒和參考。