馮格格，王猛強(qiáng)，李 壯，佘永新，王 淼，曹 振，王珊珊，鄭鷺飛，金茂俊，王 靜，邵 華，金 芬

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081）

磺酰脲類農(nóng)藥作為一種常用的田間除草劑可以有效防除頑固雜草，該類除草劑分子結(jié)構(gòu)由芳香基、磺酰脲橋和雜環(huán)3 部分組成，通過利用不同植物代謝能力、代謝途徑和降解水平的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)雜草的選擇，其被植物的根、葉吸收后，在植物的韌皮部和木質(zhì)部傳導(dǎo)，通過抑制乙酰乳酸合成酶的生成抑制植物細(xì)胞的分裂增長(zhǎng)，從而達(dá)到除草的目的[1]。因其用量小、活性高、對(duì)哺乳動(dòng)物毒性較低的特點(diǎn)，磺酰脲類除草劑已被廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、大麥、大豆、油菜等農(nóng)作物的田間除草[2]，但由于磺酰脲類除草劑大多屬于長(zhǎng)殘效除草劑，其殘留極易對(duì)敏感作物造成毒害，甚至影響下茬作物的生長(zhǎng)[3]。此外，因磺酰脲類除草劑作用位點(diǎn)單一，在特定地塊的連續(xù)施用會(huì)使雜草產(chǎn)生抗藥性，由此引發(fā)藥物濫用的惡性循環(huán)將會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境帶來重大的安全風(fēng)險(xiǎn)。人們食用了超出殘留限量的植物源性食品后，對(duì)健康產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)，甚至引起急性中毒。

目前針對(duì)磺酰脲類除草劑的殘留檢測(cè)日益成為食品安全領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。各國(guó)家先后制定了多種磺酰脲類除草劑的最高殘留限量。美國(guó)規(guī)定苯磺隆和噻吩磺隆在玉米和高粱的草料、谷粒、秸稈及豆科作物種子中的最高殘留限量為0.05 mg/kg。GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定噻吩磺隆、單嘧磺隆、環(huán)丙嘧磺隆、甲磺隆、氯磺隆等在部分農(nóng)產(chǎn)品中的最大殘留限量[4]。農(nóng)業(yè)部第2032號(hào)公告還對(duì)氯磺隆等7種農(nóng)藥采取限用管理措施，逐步限售、禁用部分危害性較高的磺酰脲類除草劑，并先后制定了多種磺酰脲類農(nóng)藥的殘留檢測(cè)方法。目前的分析方法主要包括：高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)[5]、高效液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[7]、毛細(xì)血管電泳色譜法[8]、生物測(cè)定法[9-10]、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)[11-12]等。由于檢測(cè)設(shè)備在靈敏度上存在局限性，加之復(fù)雜基質(zhì)對(duì)殘留檢測(cè)結(jié)果極易受到干擾、弱化，現(xiàn)有的檢測(cè)方法很難對(duì)種類較多的磺酰脲類除草劑進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的痕量分析[13-14]，其中樣品前處理技術(shù)是解決當(dāng)前檢測(cè)技術(shù)精準(zhǔn)度不高的主要途徑。

分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是一種具有較強(qiáng)分子識(shí)別能力的新型高分子仿生材料，分子印跡技術(shù)基本原理如下[15]：模板分子與功能單體依靠相互作用力（如氫鍵、共價(jià)鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用以及空間位阻效應(yīng)等），在合適的分散介質(zhì)中形成可逆結(jié)合的復(fù)合物，當(dāng)交聯(lián)劑存在時(shí)，經(jīng)光、熱、電場(chǎng)及引發(fā)劑引發(fā)，形成具有一定剛性和柔性的具有立體孔穴的高分子聚合物。之后除去模板分子，得到在空間和結(jié)合位點(diǎn)上與模板分子完全匹配的聚合物，即MIPs。MIPs不僅專一性高、制備簡(jiǎn)單，而且與天然的分子識(shí)別體系（如抗原和抗體、酶和底物）相比，具有高度穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的使用壽命[16-19]。以其作為固相萃取柱填料制備的分子印跡固相萃?。╩olecularly imprinted solid-phase extraction，MI-SPE）柱，與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比，它克服了樣品基質(zhì)復(fù)雜、富集效果差以及無再生性等不利因素，有效提高了分析準(zhǔn)確性和靈敏度，更適用于痕量分析[20-21]。

課題組以甲磺隆為模板分子，利用沉淀聚合法合成磺酰脲類MIPs，并將其與制備的金屬有機(jī)框架（metal organic frameworks，MOFs）材料摻雜混合作為復(fù)合填料制成MI-SPE柱，結(jié)合HPLC-MS，發(fā)展了大米樣品10種磺酰脲快速檢測(cè)方法[22]；Bastide等[23]制備了對(duì)甲磺隆等6種磺酰脲類除草劑都具有較好結(jié)合能力的MIPs；Liu Xiangjun等[24]合成了具有規(guī)則外形的甲磺隆MIPs球，可從甲磺隆、苯磺隆、芐嘧磺隆和噻吩磺隆中較好地識(shí)別甲磺隆并可以應(yīng)用于實(shí)際水樣的液相色譜檢測(cè)；Peng Yan等[25]首先通過硅烷化作用將雙鍵嫁接在二氧化硅納米顆粒的表面，合成了甲磺隆MIPs涂層的二氧化硅納米顆粒，可應(yīng)用于土壤、大米、大豆和谷物樣品中甲磺隆、氯磺隆、苯磺隆和噻吩磺隆的檢測(cè)；王寧[26]和Dong Xiaochao[27]等采用紫外光引發(fā)溶液聚合法合成了單嘧磺隆MIPs，并被成功地用作固相提取劑對(duì)土壤樣品中的單嘧磺隆進(jìn)行有效富集與凈化；鄭亞麗等[28]制備了氯磺隆MIPs微球，可作為固相萃取填料用于檢測(cè)煙葉中6種磺酰脲類除草劑；李蓉等[29]建立了復(fù)合分子印跡固相萃取-高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)多種植物源性食品中3種磺酰脲類除草劑殘留的分析方法。然而這些方法只能對(duì)特定幾種磺酰脲類農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，適用范圍窄，目前各種農(nóng)產(chǎn)品中使用磺酰脲除草劑的種類高達(dá)30多種，現(xiàn)有的方法都無法滿足快速檢測(cè)29種，因此開發(fā)高通量高效樣品前處理技術(shù)的一步式檢測(cè)29種磺酰脲類具有很好的研究?jī)r(jià)值。

因此，本研究利用雙模板分子，采用沉淀聚合法制備了磺酰脲類MIPs，研究聚合物的吸附性能，并將其作為填料制備MI-SPE柱，建立農(nóng)產(chǎn)品中29種磺酰脲類除草劑殘留量測(cè)定的MI-SPE/HPLC-MS/MS。與已有文獻(xiàn)相比[22-29]， 本實(shí)驗(yàn)建立的MI-SPE/HPLC-MS/MS方法具有前處理簡(jiǎn)單、選擇性好、回收率高、檢測(cè)限低、靈敏度高、一次處理樣品可檢測(cè)29種磺酰脲類農(nóng)藥殘留的特點(diǎn)。該方法可用于農(nóng)產(chǎn)品中29種磺酰脲類除草劑的殘留檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷物、蔬菜、水果、食用油等農(nóng)產(chǎn)品為北京市購；4-乙烯基吡啶（4-vinyl pyridine，4-VP）、二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB） 上海Aladdin公司；偶氮二異丁腈（azodiisobutyronitrile，AIBN） 北京百靈威 公司；甲醇、乙腈、正己烷（均為色譜純），甲酸、冰乙酸、磷酸（均為分析純） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀三水合物（均為分析純） 北京化學(xué)試劑公司；超純水由法國(guó) MilliQ純水機(jī)制備；29種磺酰脲類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：芐嘧磺隆、苯磺隆、煙嘧磺隆、氯磺隆、噻吩磺隆、單嘧磺隆、胺苯磺隆、氯吡嘧磺隆、甲磺胺磺隆、甲基碘磺隆鈉鹽、醚苯磺隆、乙氧嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯嘧磺隆、氟唑磺隆、嘧苯胺磺隆、酰嘧磺隆、甲磺隆、噻苯隆、氟吡磺隆、環(huán)丙嘧磺隆、醚磺隆、砜嘧磺隆、氟磺隆、氟胺磺隆、甲嘧磺隆、氟嘧磺隆、磺?；锹?、甲酰胺磺?。兌染笥?8%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200液相色譜儀、API5000串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；MS200型多管渦旋混勻儀 杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；AL104型電子天平 瑞士梅特勒-托利多 公司；Biofuge Stratos型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó) Thermo公司；ZK-82A型真空干燥箱 上海路達(dá)公司；KQ2200DB3L型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司； D10-12型干熱式氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 磺酰脲類MIPs的合成

將甲磺隆和氯磺?。ㄎ镔|(zhì)的量比為1∶1）置于150 mL的圓底燒瓶中，加入一定量的乙腈溶解，待模板分子完全溶解后加入4-VP（與模板分子物質(zhì)的量比為4∶1），置于搖床上預(yù)聚合60 min。加入DVB（與模板分子的物質(zhì)的量比10∶1）和一定量的引發(fā)劑AIBN，超聲10 min，充氮?dú)獬?0 min，密封后放入60 ℃水浴鍋振蕩 （140 r/min）反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾得到沉淀，用甲醇沖洗2～3 次，55 ℃真空干燥。之后在索氏提取器上用乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液洗脫模板，直至紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不到模板分子。非分子印跡聚合物（non molecularly imprinted polymers，NIPs）的制備除不加模板外，其余步驟與MIPs）相同。

1.3.2 聚合物的吸附性能表征

選取6種主要的磺酰脲類農(nóng)藥對(duì)其進(jìn)行吸附性能研究。分別稱取MIPs和NIPs 40 mg置于2 mL離心管中，加入1 mL不同質(zhì)量濃度的磺酰脲類溶液，恒溫振蕩9 h，離心取上清液，HPLC測(cè)定其質(zhì)量濃度，根據(jù)式（1）計(jì)算MIPs和NIPs對(duì)不同質(zhì)量濃度磺酰脲類農(nóng)藥的吸附量Q，并繪制等溫吸附曲線。根據(jù)式（2）Scatchard方程計(jì)算印跡聚合物的結(jié)合常數(shù)及最大表觀吸附量：

式中：Q為平衡時(shí)聚合物對(duì)分析物的吸附量/（μg/g）；Qmax為最大表觀吸附量/（mg/g）；C0為磺酰脲類農(nóng)藥初始質(zhì)量濃度/（mg/L）；Ce為平衡時(shí)上清液中磺酰脲類農(nóng)藥質(zhì)量濃度/（mg/L）；V為加入磺酰脲類溶液的體 積/mL；m為加入聚合物的質(zhì)量/mg；Kd為平衡離解常數(shù)。

1.3.3 分子印跡固相萃取方法的建立

采用濕法裝柱的方式，在保證吸附效率的同時(shí)考慮經(jīng)濟(jì)效益，故選擇填柱量為40 mg；由于MIPs在水中的分散性不佳，選擇2 mL乙醇為溶劑（柱上下兩端的篩板壓的力度要適中，太實(shí)會(huì)導(dǎo)致阻力大，溶液不能自然滴落；太松會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物不能與聚合物充分接觸，從而使吸附量降低），制備磺酰脲類MI-SPE柱?；罨? mL甲醇-3 mL水，并確保水在柱中未完全流干；上樣：準(zhǔn)確吸取1 mL pH 8.0的PBS樣品溶液作為上樣液，流速為 1 mL/min；淋洗：1 mL水淋洗，流干；洗脫：3 mL 乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液為洗脫液洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈桑? mL乙腈再次復(fù)溶后，經(jīng)0.22 μm微膜過濾，待測(cè)。

1.3.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

1.3.4.1 提取

玉米、大豆油：準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的樣品2.0 g于50 mL離心管中，加入10 mL超純水、10 mL乙腈溶液、4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉；高速勻漿5 min，靜置30 min，4 000 r/min離心5 min；10 mL乙腈溶液提取步驟重復(fù)3 次，合并上清液；完全轉(zhuǎn)移上清液于圓底燒瓶中，加入15 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋5 min，靜置10 min，分層；棄去上層正己烷層，將下層乙腈層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干；加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）復(fù)溶，待凈化。

黃瓜、梨：準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的樣品2.0 g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈溶劑、4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉；高速勻漿5 min，靜置30 min，4 000 r/min離心5 min；乙腈溶劑提取步驟重復(fù)3 次，合并上清液，完全轉(zhuǎn)移上清液于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干；加入2 mL PBS復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待凈化。

1.3.4.2 凈化

按照優(yōu)化好的步驟進(jìn)行活化、1 mL上樣液上樣、淋洗、洗脫程序。洗脫液氮吹后用1 mL乙腈進(jìn)行復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜，通過HPLC-MS/MS檢測(cè)回收率。

1.3.5 色譜條件

Shim-pack GIST C18色譜柱（75 mm×2.1 mm，2 μm），柱溫35 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣體積1 μL，流動(dòng)相組成及梯度洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相組成及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase composition and gradient elution conditions

1.3.6 質(zhì)譜條件

電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源，毛細(xì)管電壓為4 000 V，毛細(xì)管溫度為300 ℃，霧化氣流量為3.0 L/min，碰撞氣類型為氬氣，檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，質(zhì)譜參數(shù)條件見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 磺酰脲類MIPs制備條件的優(yōu)化

首先對(duì)模板分子進(jìn)行選擇。由于有30余種商用的磺酰脲類除草劑，因此開發(fā)一種具有良好凈化效果的類特異性分子印跡-固相萃取方法，用于同時(shí)測(cè)定復(fù)雜基質(zhì)中的多種磺酰脲類除草劑，作為理想和實(shí)用的常規(guī)監(jiān)測(cè)。雙模板分子印跡策略最近被證明是一種有效的方法，因?yàn)椴捎秒p模板分子可以在一種MIPs中產(chǎn)生多重識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)提供更大的吸附容量。模板分子是MIPs中最重要的部分，它的結(jié)構(gòu)直接影響所得聚合物的性質(zhì)[30-33]。甲磺隆和氯磺隆是最開始被開發(fā)使用的磺酰脲類除草劑，其他種類的磺酰脲類除草劑都是在其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行取代基的改變而合成的?；诩谆锹『吐然锹〉慕Y(jié)構(gòu)特性以及良好的熱穩(wěn)定性，故選擇二者作為雙模板分子，使其與功能單體通過共價(jià)或非共價(jià)鍵的相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物。從圖1可看出，采用雙模板 （甲磺隆∶氯磺隆=1∶1，n/n）作為模板分子制備的聚合物對(duì)目標(biāo)物的吸附量遠(yuǎn)大于單模板，證明了采用雙模板分子可以在一種MIPs中產(chǎn)生多重識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)提供更大的吸附容量。根據(jù)模板分子和功能單體的分子結(jié)構(gòu)，推測(cè)其原理可能是由于功能單體的吡啶基團(tuán)和模板分子磺酰脲橋上的質(zhì)子之間形成了氫鍵，也可能是功能單體的芳香族基團(tuán)和模板分子之間的π-π相互作用導(dǎo)致。

圖1 不同模板分子的比較Fig. 1 Effect of different template molecules on adsorption capacity of MIPs for sulfonylurea pesticides

采用沉淀聚合法，按照表3聚合體系進(jìn)行篩選和優(yōu)化，確定了聚合物的制備體系。結(jié)果表明：以甲磺隆和氯磺隆1∶1混合為模板分子，4-VP為功能單體，DVB為交聯(lián)劑（三者物質(zhì)的量比為1∶4∶10），乙腈為致孔劑時(shí)，制備的聚合物吸附量最高，此時(shí)可獲得對(duì)磺酰脲類農(nóng)藥具有較好的特異性識(shí)別性能和吸附容量的MIPs，故選擇此體系為聚合物的最終制備體系。其原理可能是由于功能單體的吡啶基團(tuán)和模板分子磺酰脲橋上的質(zhì)子之間形成了氫鍵，也可能是功能單體的芳香族基團(tuán)和模板分子之間的π-π相互作用導(dǎo)致。

表3 聚合物制備體系的優(yōu)化Table 3 Optimization of polymerization system

2.2 磺酰脲類MIPs的表征

采用掃描電鏡對(duì)聚合物的表面形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。以甲磺隆和氯磺隆為雙模板分子，4-VP為功能單體，DVB為交聯(lián)劑（三者物質(zhì)的量比例為1∶4∶10），30 mL乙腈作為致孔劑，采用沉淀聚合法制備的MIPs和NIPs。從圖2可以看出，MIPs粒徑均勻，大約在0.1 μm，而NIPs顆粒不規(guī)則，且表面光滑。而MIPs與NIPs團(tuán)聚體中顆粒的平均尺寸不同，可以表明模板分子在沉淀聚合的成核階段有影響，在印跡過程中印跡位點(diǎn)的形成起到重要作用。

圖2 MIPs（a）和NIPs（b）的掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electron micrographs of MIPs (a) and NIPs (b)

2.3 磺酰脲類MIPs的吸附性能

根據(jù)不同磺酰脲類除草劑的分子結(jié)構(gòu)特征，選擇6種典型的磺酰脲類農(nóng)藥進(jìn)行靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附，獲得了在2.1節(jié)確定的最優(yōu)聚合體系下制備聚合物的最大表觀吸附量及結(jié)合常數(shù)，根據(jù)聚合物的靜態(tài)吸附曲線和動(dòng)態(tài)吸附曲線對(duì)聚合物的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。由圖3可知，不同的磺酰脲類農(nóng)藥動(dòng)態(tài)吸附曲線趨勢(shì)相同，該6種目標(biāo)物在9 h之前動(dòng)態(tài)曲線隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，而9 h之后曲線均可達(dá)到平衡，故選擇9 h作為飽和吸附時(shí)間。由圖4可知，聚合物在PBS（pH 8.0）中對(duì)目標(biāo)物具有很好的吸附性能，而且隨著磺酰脲類目標(biāo)物初始質(zhì)量濃度的逐漸增大，聚合物的吸附容量逐漸增大。

圖4 MIPs的靜態(tài)吸附曲線 Fig. 4 Adsorption isotherms of MIPs for sulfonylurea pesticides

由Scatchard方程（圖5）可知，Q/Ce與Q整體呈線性關(guān)系，Scatchard圖是由兩部分組成，分別為兩條斜率不同的線性直線。這表明MIPs中的結(jié)合位點(diǎn)在親和力方面是異質(zhì)的（特異性和非特異性結(jié)合位點(diǎn)）。根據(jù)擬合的線性方程可以計(jì)算得出MIPs中結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)Kd以及對(duì)應(yīng)的最大表觀吸附量Qmax，計(jì)算結(jié)果如表4所示，從結(jié)果可以看出MIPs對(duì)磺酰脲類農(nóng)藥具有良好的吸附性能，其最大表觀結(jié)合量為13.21 mg/g。

表4 聚合物結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)Kd以及對(duì)應(yīng)的最大表觀吸附量QmaxTable 4 Kd and Qmax for binding of sulfonylurea pesticides to MIPs

圖5 MIPs的Scatchard方程Fig. 5 Scatchard equations for adsorption of sulfonylurea pesticides by MIPs

2.4 印跡聚合物類特異吸附性

為考察磺酰脲類MIPs的類特異吸附性能，選擇三嗪類（莠去津）、三唑類（滅菌唑）和有機(jī)磷類（草甘膦）農(nóng)藥作為競(jìng)爭(zhēng)底物，采用平衡靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，通過HPLC法測(cè)定聚合物對(duì)包括磺酰脲類在內(nèi)的四大類典型農(nóng)藥的吸附量。MIPs和NIPs的類特異性吸附結(jié)果如圖6所示。其中MIPs對(duì)磺酰脲類、三嗪類、三唑類和有機(jī)磷類農(nóng)藥的吸附量分別為2.2、0.8、0.4 mg/g和0.59 mg/g，NIPs分別為1.4、0.3、0.18 mg/g和0.23 mg/g。MIPs對(duì)磺酰脲類農(nóng)藥的吸附量明顯高于其他3 類農(nóng)藥，表明制備的印跡聚合物對(duì)目標(biāo)分子（磺酰脲類除草劑）具有類特異性吸附的能力。

圖6 MIPs類特異性吸附結(jié)果Fig. 6 Specific adsorption of sulfonylurea pesticides on MIPs

2.5 磺酰脲類分子印跡固相萃取條件的優(yōu)化

為得到具有較好特異性吸附和富集效果的MI-SPE方法，對(duì)MI-SPE方法的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

首先，選擇不同的上樣液（乙腈、甲醇、PBS（pH 8.0）、乙腈-PBS（1∶9，V/V，pH 8.0）、乙腈-PBS（1∶1，V/V，pH 8.0）、乙腈-PBS（9∶1，V/V，pH 8.0））以研究目標(biāo)分析物在MI-SPE柱中的保留效果（圖7）。結(jié)果表明，當(dāng)選擇PBS（pH 8.0）為上樣液時(shí)，目標(biāo)分析物在MI-SPE柱上的保留效果最好。盡管乙腈是聚合過程中的致孔劑，但當(dāng)上樣液中含有乙腈和甲醇時(shí)，目標(biāo)分析物在柱中的保留效果降低。

圖7 不同上樣液間的比較Fig. 7 Effect of different loading solutions on recoveries of sulfonylurea pesticides

為減少樣品基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，選擇超純水、乙腈和甲醇作為淋洗液，以進(jìn)一步優(yōu)化淋洗液。如圖8a所示，當(dāng)使用乙腈和甲醇作為淋洗液時(shí)，目標(biāo)分析物會(huì)不同程度地被洗掉，導(dǎo)致回收率降低，而當(dāng)選擇超純水作為淋洗液時(shí)，可以最大程度地提高目標(biāo)分析物與結(jié)合位點(diǎn)之間的特異性相互作用，并減少非特異性相互作用。由于乙腈和甲醇均可以不同程度從固相萃取柱上洗脫目標(biāo)分析物，因此，在考察洗脫液時(shí)，不僅選擇酸化的甲醇，而且選擇不同體積的乙腈和甲醇作為洗脫液，對(duì)回收率進(jìn)行比較。如圖8b所示，使用3 mL乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液作為洗脫液可確保目標(biāo)分析物高回收率，故選擇3 mL乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液作為洗脫液。

圖8 不同淋洗液（a）和洗脫液（b）間的比較Fig. 8 Effect of different washing solutions (a) and elution solutions (b) on recoveries of sulfonylurea pesticides

最終確定的磺酰脲類MI-SPE柱萃取方法為稱取40 mg聚合物，以該聚合物作為固相萃取填料，濕法填柱制備了MI-SPE柱?？刂屏魉? mL/min，以3 mL甲醇、3 mL水為活化液，以1 mL的PBS（pH 8.0）樣品溶液為上樣液，1 mL純水作為淋洗液，3 mL 10%乙酸-甲醇為洗脫液，此條件下磺酰脲類目標(biāo)物回收率最高。

2.6 方法學(xué)評(píng)價(jià)

配制6種系列質(zhì)量濃度的29種磺酰脲類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定（2、5、10、20、50 μg/L 和100 μg/L），以各組分的3 次平均峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X，μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，HPLC-MS/MS的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)見表5。結(jié)果表明，29種磺酰脲類除草劑在2～100 μg/L范圍內(nèi)線性非常好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，由此可見，本實(shí)驗(yàn)方法可滿足定量分析要求。

表5 29種磺酰脲類除草劑HPLC-MS/MS測(cè)定線性關(guān)系Table 5 Linear equations for quantitation of 29 sulfonylurea herbicides with HPLC-MS/MS

續(xù)表5

向空白農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)中添加29種磺酰脲混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量為10、20 μg/kg和50 μg/kg，3個(gè)平行，按照1.3.4節(jié)的方法進(jìn)行前處理，用HPLC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)。由表6可知，29種磺酰脲類農(nóng)藥在4種不同農(nóng)產(chǎn)品中的平均回收率在74.8%～110.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）在0.4%～5.3%之間。以方法的最低添加量為定量限（limit of quantitation，LOQ），農(nóng)產(chǎn)品中29種磺酰脲類農(nóng)藥的LOQ為10.0 μg/kg。

表6 不同農(nóng)產(chǎn)品中29種磺酰脲類農(nóng)藥的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和LOQ（n= 3）Table 6 Recoveries, RSDs and LOQs of 29 sulfonylurea herbicides in different agricultural products (n = 3)

2.7 不同檢測(cè)方法的比較

從樣品制備、分離檢測(cè)技術(shù)、分析物個(gè)數(shù)、基質(zhì)、線性范圍、回收率等方面與其他檢測(cè)磺酰脲類藥物的方法進(jìn)行比較。如表7所示，開發(fā)的MIP-SPEHPLC-MS/MS方法具有靈敏度高、精密度好、檢出限低的優(yōu)點(diǎn)?？捎糜趶?fù)雜農(nóng)產(chǎn)品中29種磺酰脲類藥物的特異性檢測(cè)。

表7 本研究與其他方法測(cè)定磺酰脲類除草劑的比較Table 7 Comparison of HPLC-MS/MS with other methods for the determination of sulfonylurea herbicides

3 結(jié) 論

利用甲磺隆和氯磺隆為雙模版分子，以4-VP為功能單體，DVB為交聯(lián)劑，乙腈為致孔劑，采用沉淀聚合法制備了磺酰脲類MIPs。實(shí)驗(yàn)對(duì)聚合物選擇性吸附效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，表明聚合物對(duì)磺酰脲類農(nóng)藥具有良好的選擇性和吸附性。以此聚合物為填料制備的MI-SPE柱對(duì)不同農(nóng)產(chǎn)品樣品中29種磺酰脲類農(nóng)藥進(jìn)行分離富集，大大降低了HPLC-MS/MS檢測(cè)中的基質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)建立的29種磺酰脲類農(nóng)藥的分析方法將樣品的提取、凈化和富集一步進(jìn)行，節(jié)約了樣品前處理時(shí)間，減少了有機(jī)試劑的應(yīng)用，且方法的準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度均滿足殘留檢測(cè)要求，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。