齊春艷，許秀麗，國 偉，李 翔，吳玉平

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.廣東省食品檢驗所（廣東省酒類檢測中心），廣東 廣州 510000）

真菌毒素又名霉菌毒素，是真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的小分子次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于谷物、蔬菜和水果等農(nóng)產(chǎn)品及其制成品中[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素高達400余種，其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、AFB2、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）等較為常見。大部分真菌毒素在烹調(diào)加熱或加工條件下不易被破壞，且具有致癌、致畸、致突變的“三致”作用，以及免疫抑制、生殖紊亂、器官損傷等毒性作用，嚴重威脅人類及動物的生命健康[2-4]。真菌毒素污染因其普遍性、嚴重性以及防控難等特點，已成為世界性的公共安全問題[5-6]。

目前真菌毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[7-8]、 薄層色譜法[9]、毛細管電泳法[10-11]、液相色譜法等[12-14]，這些傳統(tǒng)的檢測方法具有成本低廉、操作簡單等優(yōu)點，但是也存在靈敏度不高、假陽性率高，且一次只能檢測一種或一類真菌毒素等缺點，無法滿足痕量水平下真菌毒素的高通量檢測的需求。近年來，質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，尤其是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，在真菌毒素檢測方面的優(yōu)勢日益凸顯[15-16]。其中，超高效液相色譜-四極桿/靜電軌道離子阱高分辨質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q/Orbitrap HRMS）結(jié)合了四極桿的高選擇性和離子阱的高靈敏度、高分辨率的優(yōu)勢，可實現(xiàn)目標物的準確定性。與三重四極桿相比，UPLC-QOrbitrap HRMS無需逐個優(yōu)化目標物質(zhì)譜參數(shù)，且打破了傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜檢測化合物數(shù)量的限制，可滿足真菌毒素的高通量篩查[17]。

目前真菌毒素最常見的前處理方法是采用免疫親和柱或多功能凈化柱等凈化柱進行固相萃取[18-19]，這些方法存在過程繁瑣、耗時長、成本高等問題，且無法滿足樣品中多種毒素快速、準確檢測的需求。Anastassiades等[20]在基質(zhì)固相分散的基礎(chǔ)上開發(fā)了QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safety）快速樣品前處理技術(shù)，其原理是利用PSA、C18或GCB等吸附劑與基質(zhì)中的雜質(zhì)（蛋白、脂肪酸、色素等）相互作用，吸附雜質(zhì)從而達到除雜凈化的目的。該方法具有快速、經(jīng)濟、高效等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、食品添加劑、真菌毒素等各個檢測領(lǐng)域[21-26]。

小麥是我國第二大糧食作物，我國一半以上的居民以小麥為主食，因此小麥及制品在我國食品消費中占據(jù)重要地位[27]。2016—2019年國家糧食加工品監(jiān)督抽檢結(jié)果顯示，小麥粉的主要問題為真菌毒素超標[28]，因此本實驗以小麥粉為研究對象，采用UPLC-Q/Orbitrap HRMS技術(shù)與QuEChERS前處理方法相結(jié)合，建立小麥粉中9種真菌毒素的快速篩查、精準定性和準確定量方法。通過一級全掃描獲得目標物的精確質(zhì)量數(shù)，進行定性和定量。同時結(jié)合數(shù)據(jù)依賴性二級掃描模式獲得目標物的二級特征質(zhì)譜圖，為準確定性提供雙重保障。本研究能夠快速、準確、高效地完成小麥粉中真菌毒素的快速篩查和定量測定，旨在為保障我國食品安全提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9種真菌毒素標準品：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、OTA、OTB、OTC標準溶液 美國Romer Labs公司；2種真菌毒素同位素內(nèi)標品：13C17-AFB1、13C20-OTA標準溶液 美國Romer Labs公司。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（均為色譜純） 美國Thermo Fisher公司；乙酸銨（LC-MS級） 德國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；超純水（實驗室一級水）由Milli-Q超純水機制備。

QuEChERS提取鹽包（4 g硫酸鎂、1.0 g氯化鈉、1.0 g檸檬酸二鈉鹽水合物、0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物） 美國安捷倫科技有限公司；dSPE凈化管（150 mg PSA、150 mg C18、900 mg硫酸鎂） 美國安捷倫科技有限公司；GHP針式過濾器（0.2 μm） 美國波爾有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀 美國Dionex公司；Q-Exactive Orbitrap超高分辨質(zhì)譜儀 美國 Thermo Fisher公司；XP 105DR電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；移液器（1～10 μL、10～100 μL、100～ 1 000 μL、0.5～5.0 mL） 德國Eppendorf公司；Vortex-Genie2多功能旋渦混合器 美國Scientific Industries公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限 公司；Allegra X-22R離心機 美國貝克曼庫爾特有限 公司；MFV-24智能氮吹儀 得泰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）；進樣量5.0 μL；柱溫35 ℃；流動相：A為2 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），B為甲醇；流速0.30 mL/min；梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：加熱電噴霧電離源；掃描模式：正離子模式；采集模式：全掃描/數(shù)據(jù)依賴性二級掃描；鞘氣流量：40 arb；輔助氣流量：10 arb；噴霧電壓：3.8 kV；離子源溫度：350 ℃；毛細管溫度：320 ℃。一級掃描范圍：m/z100～1 000；一級掃描分辨率70 000；自動增益控制進入軌道阱中的離子數(shù)（AGC target）：1×106；最大注入時間（Maximum IT）：100 ms；二級掃描分辨率：17 500；AGC target：1×105； Maximum IT：50 ms；歸一化碰撞能量：20、40、60 eV。9種真菌毒素質(zhì)譜信息見表2。

表2 9種真菌毒素的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Mass spectral parameters for nine mycotoxins

1.3.3 小麥粉樣品處理

稱取均勻試樣2.0 g置于50 mL聚四氟乙烯離心管中，準確加入5.0 mL水，渦旋，樣品充分浸潤后，加入10 mL 2.0%甲酸-乙腈溶液，渦旋振蕩2 min，超聲10 min，加入QuEChERS提取鹽包，振搖1 min， 10 000 r/min離心5 min。取8.0 mL上清液轉(zhuǎn)移至含有復合吸附劑的dSPE凈化管中，渦旋1 min，10 000 r/min離心5 min。取上清液5.0 mL至氮吹管中，于40 ℃水浴下，氮氣吹干。加入內(nèi)標溶液，用80%甲醇溶液定容至1.0 mL，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm濾膜，供UPLC-Q-Orbitrap HRMS測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

分別采用SPSS 22.0軟件和Origin 8.0軟件進行統(tǒng)計分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利用UPLC-Q-Orbitrap HRMS對9種真菌毒素混合標準溶液進行正負離子掃描，得到一級全掃描質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2在負離子模式下無響應(yīng)，OTA、OTB、OTC在正離子模式下響應(yīng)值高于負離子模式，最終確定掃描模式為正離子模式。9種真菌毒素的分子離子峰均為[M+H]+，且9種真菌毒素的精確質(zhì)量相對偏差小于不大于1.91×10-6（表2），符合高分辨質(zhì)譜檢測的要求[29]。同時采用數(shù)據(jù)依賴性二級掃描，采集目標物的二級質(zhì)譜圖作為進一步的定性依據(jù)（表3）。

表3 9種真菌毒素的主要碎片離子Table 3 Major fragment ions of nine mycotoxins

2.2 流動相的選擇

本實驗考察3種不同的流動相體系，分別為0.1%甲酸溶液-甲醇體系、0.1%甲酸溶液-乙腈體系、2 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-甲醇體系。結(jié)果顯示，有機相為甲醇時，各真菌毒素的響應(yīng)高于乙腈體系，因此選擇甲醇作為有機相。同時在水相中加入0.1%甲酸和2 mmol/L 乙酸銨，在一定程度上改善峰形，同時乙酸銨的加入可以抑制[M+Na]+峰，提高[M+H]+峰的響應(yīng)，從而提高分析靈敏度。因此最終選擇2 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-甲醇體系作為流動相。各真菌毒素圖譜見圖1。

圖1 9種真菌毒素和同位素內(nèi)標的提取離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion current chromatograms of nine mycotoxins and isotope internal standards

2.3 提取條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑是決定化合物回收率高低的一個至關(guān)重要的因素。為獲得盡可能高的回收率和盡可能少的基質(zhì)干擾，本實驗選取甲醇和乙腈作為提取溶劑進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇雖然比乙腈具有更好的溶解性，但易將小麥粉中的蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等雜質(zhì)提取出來，導致提取液中基質(zhì)干擾較多，不利于后續(xù)的鹽析和凈化，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

部分毒素具有羧基基團，如OTA、OTB等，降低提取溶劑的pH值能提高含羧基基團毒素的穩(wěn)定性和回收率。因此本實驗對比甲酸體積分數(shù)對回收率的影響情況。結(jié)果顯示，當甲酸體積分數(shù)分別為0.1%、0.5%、1%、2%以及5%時，9種真菌毒素的平均回收率分別為80.0%、85.0%、97.8%、102%以及102%。不同種類真菌毒素回收率受提取溶劑中甲酸含量的影響不同，其中6種黃曲霉毒素的回收率受提取溶劑中甲酸體積分數(shù)變化的影響較小，3種赭曲霉毒素類的回收率隨著提取溶劑中甲酸含量的增大而增加。在甲酸體積分數(shù)為0.1%時，OTA和OTB兩種毒素基本無回收率。當甲酸體積分數(shù)達到5%時，回收率基本穩(wěn)定，與甲酸體積分數(shù)為2.0%無明顯差異（P＞0.05）（圖2）。因此，選擇2.0%甲酸-乙腈作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對9種真菌毒素回收率的影響Fig. 2 Effect of extraction solvents on the recoveries of nine mycotoxins

2.3.2 提取溶劑體積的選擇

提取溶劑體積同樣也對化合物回收率有一定影響。本實驗對比提取溶劑體積為5、10 mL以及15 mL時，各目標化合物的回收率情況。結(jié)果顯示，當提取溶劑體積5、10 mL以及15 mL時，9種真菌毒素的平均回收率為92.6%、100%以及99.7%。大部分真菌毒素回收率隨著提取溶劑體積的增加而增大。OTB、OTC隨著提取溶劑體積的增加回收率先增加后減小，這可能由于提取溶劑體積增加，提取到的雜質(zhì)也隨之增加，使得回收率有所降低（圖3）。因此，綜合回收率、濃縮時間兩方面因素，最終選擇提取溶劑體積為10 mL。

圖3 提取溶劑體積對9種真菌毒素回收率的影響Fig. 3 Effect of extraction solvent volume on the recoveries of nine mycotoxins

2.3.3 復溶溶劑的選擇

復溶溶劑是指用來溶解樣品濃縮后所得殘渣的溶液。選取不同的復溶溶劑溶解樣品殘渣對目標化合物回收率有一定的影響，特別是極性較小的真菌毒素，需要較高比例有機相才能溶解，但有機相比例含量過高，可能會出現(xiàn)較大的溶劑效應(yīng)。因此實驗比較50%乙腈溶液、50%甲醇溶液、80%乙腈溶液以及80%甲醇溶液作為復溶溶劑對回收率的影響（圖4）。結(jié)果顯示，復溶溶劑為50%乙腈溶液、50%甲醇溶液、80%乙腈溶液以及80%甲醇溶液時，9種真菌毒素的平均回收率分別為97.2%、92.0%、100%以及99.3%。其次，根據(jù)選用的流動相類型，最終選取80%甲醇溶液作為復溶溶劑。

圖4 復溶溶劑對9種真菌毒素回收率的影響Fig. 4 Effect of re-dissolving solvents on the recoveries of nine mycotoxins

2.4 線性范圍、檢測限、定量限測定結(jié)果

以9種真菌毒素標準品的峰面積為縱坐標，相應(yīng)質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標，進行線性回歸計算，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。確定該方法的線性范圍、線性方程、檢出限、定量限見表4。結(jié)果表明，9種真菌毒素在0.25～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.99。檢出限范圍為0.10～1.00 μg/kg，定量限范圍為0.30～3.00 μg/kg，低于GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定的指標[30]。

表4 9種真菌毒素的線性范圍、檢出限和定量限Table 4 Linear ranges, LODs and LOQs of nine mycotoxins

2.5 回收率和精密度實驗結(jié)果

根據(jù)各真菌毒素在小麥粉基質(zhì)中的定量限，設(shè)計低、中、高3個水平的加標實驗，計算加標回收率和相對標準偏差。如表5所示，9種真菌毒素的加標回收率為70.2%～112.0%，相對標準偏差為0.2%～4.5%，說明本實驗方法滿足實驗要求。

表5 9種真菌毒素的加標回收率和相對標準偏差（n=3）Table 5 Spiked recoveries and precision RSD of nine mycotoxins (n = 3)

2.6 實際樣品測定結(jié)果

采用本研究建立的方法對從超市購買的19 份小麥粉進行檢測，采用一級精密質(zhì)量數(shù)和保留時間對樣品中的9種真菌毒素進行定性篩查，并結(jié)合二級特征碎片離子確證。其中一份面粉樣品檢出AFB1，含量為 0.89 μg/kg，參考GB 2761—2017限量標準規(guī)定的小麥粉AFB1的限量為5.0 μg/kg，未超過限量值[30]。該結(jié)果與GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》[31]檢測結(jié)論一致。

3 結(jié) 論

本實驗將UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)與QuEChERS前處理方法的優(yōu)勢相結(jié)合，用于小麥粉中9種真菌毒素的快速篩查、精準定性和準確定量研究。超高分辨質(zhì)譜儀通過一級全掃描獲得目標物的精確質(zhì)量數(shù)，在一定程度上消除基質(zhì)干擾，提高定性和定量準確性。同時以數(shù)據(jù)依賴性二級掃描模式獲得目標物的二級特征質(zhì)譜圖和保留時間等為基礎(chǔ)，構(gòu)建了真菌毒素類物質(zhì)數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫作為自建質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫可以不斷擴充，從而實現(xiàn)小麥粉中真菌毒素的快速篩查和精準確證。本研究能夠快速、準確、高效地完成小麥粉中真菌毒素的快速篩查和定量測定，為保障我國食品安全提供技術(shù)支持。