郭添榮，吳文林,,*，張 崟，萬渝平，葉 梅，陳代偉，黃 霞，張龍翼

（1.成都市食品檢驗研究院，四川 成都 611130；2.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.成都大學(xué) 肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗室，四川 成都 610106）

激素是由生物體分泌且具有調(diào)節(jié)或影響機(jī)體生長代謝的微量活性物質(zhì)，主要包括蛋白同化激素、糖皮質(zhì)激素等[1]。蛋白同化激素具有蛋白質(zhì)同化作用，可以有效促進(jìn)骨骼發(fā)育壯大，縮短動物生長周期[2-3]。糖皮質(zhì)激素具有調(diào)節(jié)動物機(jī)體的脂肪、糖類合成和代謝作用，促進(jìn)動物生長繁殖，因此存在以提高經(jīng)濟(jì)利益為目的在魚類養(yǎng)殖中違規(guī)使用的現(xiàn)象[4-6]。研究表明，長期食用蛋白同化及糖皮質(zhì)激素含量超標(biāo)的食品，可能引起腎上腺功能亢進(jìn)、肥胖以及骨質(zhì)疏松等疾病[7-10]。我國農(nóng)業(yè)部第235號公告和GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》中對激素藥物限量具有明確規(guī)定[11]，歐盟與美國相關(guān)組織也早已頒布了相關(guān)禁限令[12-13]。為滿足監(jiān)管需要，建立一種多目標(biāo)快速篩查激素殘留的方法顯得十分必要。

目前蛋白同化激素及糖皮質(zhì)激素殘留檢測方法主要有免疫分析法[14]、高效液相色譜法[15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-18]、液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法[19-20]等。其中免疫分析法檢測周期較長且受活性酶種類限制而逐漸被取代，高效液相色譜法僅能分離幾種特定的物質(zhì)且難以區(qū)分相同或相近物質(zhì)而應(yīng)用受限，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖為主流檢測方法，但受到分析模式和分辨率限制，難以實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜樣品的高通量多目標(biāo)分析，液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法具有靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)勢，但因串級功能不全以及面對同分異構(gòu)體物質(zhì)分辨率不夠而定性能力受到限制[21]。超高效液相色譜-四極桿/靜 電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high-resolution mass spectrometry，UPLC-Q/Orbitrap HRMS）法將高選擇性的四極桿與超高分辨率、高靈敏度的靜電場軌道阱有機(jī)結(jié)合，針對復(fù)雜樣品基質(zhì)的多種激素檢測，在建立激素數(shù)據(jù)可追溯性電子身份數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)在無標(biāo)準(zhǔn)品對照情況下對化合物進(jìn)行大批量多目標(biāo)快速篩查[22-23]，目前已被廣泛應(yīng)用于組學(xué)研究、環(huán)境檢驗以及違禁藥物檢查等[24-27]眾多領(lǐng)域，研究報道多應(yīng)用于肉類食品與保健品中多肽類、大環(huán)內(nèi)酯類以及糖皮質(zhì)類[28-29]的篩查，本實(shí)驗將該技術(shù)用于魚肉中30種蛋白同化及糖皮質(zhì)激素的多目標(biāo)快速篩查研究，以期為魚類中激素殘留風(fēng)險監(jiān)測提供有效的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（均為色譜級） 美國Thermo Scientific公司；甲酸、乙酸銨（均為色譜級） 美國Sigma Aldrich公司；Oasis?HLB、Oasis?PRiME HLB固相萃取柱（6 mL 200 mg） 美國Waters公司；Captiva EMR Lipid固相萃取柱（6 mL 600 mg）、陶瓷均質(zhì)子（100個/瓶） 美國Agilent公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，25 ℃） 美國Millipore公司；10種蛋白同化激素標(biāo)準(zhǔn)品（去氫睪酮、表睪酮、氟甲睪酮、甲睪酮、諾龍、丙酸睪酮、群勃龍、美雄酮、苯丙酸諾龍、美睪酮） 美國Cato Research Chemicals Inc公司；20種糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品（丙酸倍氯米松、倍他米松、醋酸可的松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍、曲安奈德、曲安西龍、可的松、地塞米松、醋酸氫化可的松、倍氯米松、氟米松、布地奈德、醋酸氟輕松、醋酸氟氫可的松、氟米龍、丙酸氯倍他索、醛固酮、潑尼松，純度均不小于95.0%） 中國食品藥品檢定研究院；36 批次魚（多寶魚、鱖魚、烏魚和草魚各9 批次） 市購。

1.2 儀器與設(shè)備

Vanquish Horizen-Q Exactive Plus高分辨質(zhì)譜系統(tǒng) 美國Thermo Fisher公司；ORTEX3旋渦混勻器、 T18 basic均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma Aldrich公司；Turbovap LV濃縮氮吹儀 美國Biotage Caliper Zymark公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；ME203型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g（精確至0.01 g）勻漿試樣，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入80%乙腈溶液（含0.2%甲酸）10 mL，靜置10 min后再加入兩粒陶瓷均質(zhì)子，快速劇烈振搖并旋渦振蕩30 min（2 000 r/min）使樣品充分散開，9 500 r/min高速離心5 min，取上清液待凈化。取5 mL準(zhǔn)確量取的上清液過6 mL 200 mg的Oasis PRiME HLB固相萃取柱，流速為1 滴/s，收集4 mL后半段流出液并準(zhǔn)確量取2 mL，氮?dú)庀麓抵两桑跏剂鲃酉喽ㄈ葜? mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，同時做試劑空白實(shí)驗一同上機(jī)測試。

1.3.2 儀器條件

UPLC條件：Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；色譜柱溫度25 ℃；流速0.5 mL/min；流動相A（水相）為含0.1%甲酸的乙酸銨（20 mmol/L） 溶液，流動相B（有機(jī)相）為乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min，95% A、5% B；0.5～15 min，2% A、98% B；15～20 min，2% A、98% B；20～20.1 min，95% A、5% B；20.1～25 min，95% A、5% B。進(jìn)樣量10 μL。

HRMS條件：加熱電噴霧離子源；掃描采集方式：正負(fù)離子同時采集，一級全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full MS/dd-MS2）（Top N）；噴霧電壓3.5 kV（+），-3.0 kV（-）；離子傳輸管及加熱器溫度325 ℃和450 ℃；鞘氣及輔助氣（N2）流速：35 arb和10 arb；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000；分辨率75 000（Full MS）、17 500（dd-MS2）；C-Trap中離子數(shù)最大容量：3×106（Full MS）、2×105（dd-MS2）；C-Trap中最大注入時間：100 ms（Full MS）和50 ms（dd-MS2）。

1.3.3 數(shù)據(jù)庫的建立

本研究基于Xcalibur 4.1中TraceFinder 4.1和mzVault軟件搭建數(shù)據(jù)庫。首先收集30種激素化合物的中英文名稱、分子式、CAS號等基本信息，并在Full MS全掃描模式下獲取30種化合物的準(zhǔn)確保留時間、母離子精確質(zhì)量數(shù)等信息（表1），隨即導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫中，得到可用于高通量快速篩查的指紋識別數(shù)據(jù)庫。在dd-MS2模式下，經(jīng)不同碰撞能量下發(fā)生裂解得到的高能量碰撞解離（high energy collision dissociation，HCD）碎片離子質(zhì)譜圖匯總形成用于進(jìn)一步譜圖匹配確證的譜圖庫。

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)的計算

將30種激素標(biāo)準(zhǔn)品分別通過4種魚肉基質(zhì)以及甲醇制備為標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過甲醇純?nèi)軇┖突|(zhì)溶液中同一物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比，對化合物的基質(zhì)效應(yīng)狀況進(jìn)行評價?；|(zhì)效應(yīng)按下式計算：

評價依據(jù)：80%≤基質(zhì)效應(yīng)≤120%，表示基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可忽略不計；基質(zhì)效應(yīng)＜80%或基質(zhì)效應(yīng)＞120%，表示基質(zhì)抑制或增強(qiáng)，說明存在基質(zhì)效應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在TraceFinder 4.1分析軟件中，運(yùn)用建立好的指紋識別數(shù)據(jù)庫對UPLC-Q/Orbitrap采集的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索匹配分析，利用質(zhì)譜軟件的自動去卷積功能，并與指紋識別數(shù)據(jù)庫中的保留時間、精確母離子質(zhì)量數(shù)、碎片離子質(zhì)量數(shù)等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行對比（可疑化合物判定：保留時間偏差介于±0.5 min，離子質(zhì)量數(shù)偏差介于±5×10-6）， 針對可疑化合物利用HCD碎片離子譜圖庫進(jìn)一步確證，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。借助OriginPro 2019b和WPS Office 2019搭配制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑及體積的選擇

文獻(xiàn)[30-31]報道，常用提取劑有乙酸乙酯、乙腈、乙腈溶液且添加適量甲酸可有效增加提取效率，本實(shí)驗以多寶魚、鱖魚、烏魚和草魚為基質(zhì)，以試樣加標(biāo)測定值與試樣濃度之差除以加標(biāo)量計算單個基質(zhì)的平均加標(biāo)回收率，考察乙酸乙酯、乙腈、體積分?jǐn)?shù)80%與90%的乙腈溶液、含0.2%與1.0%甲酸的80%乙腈溶液6種提取劑下30種激素的提取效果，結(jié)果見圖1A。乙酸乙酯和純乙腈作為提取溶劑，4種魚肉的加標(biāo)回收率處于較低水平，可能是兩者共提物較多且易結(jié)塊；乙腈溶液提取效率明顯高于乙酸乙酯和純乙腈，可能是乙睛溶液具有蛋白沉淀作用，其中體積分?jǐn)?shù)80%的乙腈溶液提取效率高于體積分?jǐn)?shù)90%，可能是高體積分?jǐn)?shù)乙腈下目標(biāo)化合物被大量變性蛋白質(zhì)包裹而不易被解離提??；體積分?jǐn)?shù)80%乙腈溶液中加入0.2%甲酸提取效率高于1.0%甲酸，可能是高體積分?jǐn)?shù)甲酸降低了樣品溶解性，影響了離子化效率。故選擇0.2%甲酸-80%乙腈溶液為提取溶劑。

圖1 提取溶劑種類（A）及最適提取溶劑體積（B） 對30種激素回收率的影響Fig. 1 Effects of different extraction solvents (A) and different volumes of 80% acetonitrile aqueous solution containing 0.2% formic acid (B) on recoveries of 30 hormones

在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗分別考察80%乙腈-0.2%甲酸溶液體積為5、10、15 mL對30種待測激素提取效果的影響，見 圖1B。使用10 mL提取溶劑的平均回收率均明顯高于5 mL，而10 mL與15 mL提取溶劑的平均回收率無顯著差異，可能是在10 mL提取溶劑下目標(biāo)化合物已基本實(shí)現(xiàn)提取完全?？紤]成本與環(huán)保節(jié)能，最終選擇10 mL作為提取劑體積。

2.1.2 固相萃取柱及填料量的選擇

魚肉基質(zhì)復(fù)雜，樣品經(jīng)提取后仍需凈化。實(shí)驗分別考察C18、Oasis HLB、Oasis PRiME HLB和Captiva EMR Lipid四種萃取柱對4 類魚肉中激素分離凈化效果，結(jié)果見圖2A。采用C18時，4 類魚肉中30種激素平均回收率最低，可能是由于傳統(tǒng)C18吸附劑難以同時兼顧所有激素性質(zhì)，Oasis PRIME HLB的凈化效果均明顯優(yōu)于Oasis HLB和Captiva EMR Lipid，表明Oasis PRIME HLB能夠更好地對樣品中的磷脂和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)進(jìn)行吸附。另有研究表明[32]，PRIME HLB是多獸殘專用且適配高分辨質(zhì)譜，該萃取柱無需活化與平衡且效果顯著，適合大規(guī)模樣品的快速凈化處理。

圖2 萃取柱（A）及填料量（B）對30種激素回收率的影響Fig. 2 Effects of different extraction columns (A) and packing amounts (B) on recoveries of 30 hormones

同時，實(shí)驗考察Oasis PRIME HLB不同填料用量（1 mL 30 mg、3 mL 60 mg、3 mL 150 mg、6 mL 200 mg、6 mL 500 mg）對目標(biāo)物的吸附凈化效果。見圖2B。當(dāng)填料由1 mL 30 mg增加到3 mL 150 mg時，4 類魚肉的萃取效率迅速提高；當(dāng)填料高于3 mL 150 mg時效率增速放緩；當(dāng)填料量為6 mL 200 mg和6 mL 500 mg時，兩者對多寶魚中激素的吸附凈化效果相當(dāng)，但前者對其他3 類魚肉基質(zhì)的吸附效果均最好。故最佳填料量為 6 mL 200 mg。

2.2 UPLC條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

要同時實(shí)現(xiàn)對30種性質(zhì)不同激素的有效分離，需要選取兼容性、柱效較好且耐用的色譜柱。實(shí)驗考察Thermo Accucore aQ C18（2.1 mm× 00 mm，2.6 μm）、Agilent Eclipse plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）以及Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）3種色譜柱對30種化合物的分離效果。結(jié)果表明，部分激素在Thermo Accucore aQ C18和Agilent Eclipse plus C18色譜柱上均存在不同程度的峰形拖尾和峰形尖銳度較差的現(xiàn)象。而Waters Acquity BEH C18色譜柱能夠較好保留30種激素化合物，峰形無明顯拖尾且尖銳對稱?？赡苁怯捎谠撋V柱獨(dú)特的鍵合與極性基團(tuán)端基封尾技術(shù)，確保了其兼顧不同極性化合物的保留性能更佳。故本實(shí)驗色譜柱選擇Waters Acquity BEH C18（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）。

2.2.2 流動相體系及流速的選擇

流動相體系直接影響分析物的保留時間和峰形，由于30種激素均易溶于乙腈，因此本實(shí)驗分別選取乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-20 mmol/L乙酸銨、乙腈-20 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）共4種流動相組合進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：乙腈-水作為流動相時，各組分的峰形較差且正離子響應(yīng)較低；乙腈-5 mmol/L乙酸銨所獲取的色譜峰形明顯優(yōu)于乙腈-水，但部分蛋白同化激素存在峰形較差。當(dāng)乙酸銨濃度加大至20 mmol/L時，峰形均得到明顯改善，繼續(xù)向乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液中添加0.1%甲酸，此時各待測物峰形均達(dá)到最佳，表明適量甲酸的加入有助于改善峰形。故本實(shí)驗流動相體系為乙腈-20 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）溶液。在此基礎(chǔ)上考察0.3、0.4 mL/min和0.5 mL/min三種流速下待測物的分離效果。結(jié)果表明，在3種流速下，30種目標(biāo)化合物均能有效分離，而當(dāng)流速為0.5 mL/min時，不僅色譜峰形尖銳，還能夠最大限度地縮短保留時間，故流動相流 速為0.5 mL/min。

2.3 HRMS條件的優(yōu)化

30種激素化合物在加熱電噴霧離子源下產(chǎn)生多種準(zhǔn)分子碎片離子峰，實(shí)驗采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full MS/dd-MS2）模式，對30種激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行正負(fù)離子同時掃描，得到一級全掃描質(zhì)譜圖，以各化合物的準(zhǔn)分子碎片離子峰理論精確質(zhì)量數(shù)提取色譜圖，此條件下30種化合物的精確質(zhì)量相對偏差均小于1.0×10-6，滿足實(shí)驗需求。同時，實(shí)驗還在多種分辨率值考察中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一級全掃描質(zhì)量分辨率為75 000，數(shù)據(jù)依賴二級掃描質(zhì)量分辨率為17 500時，30種激素待測物與樣品基質(zhì)中的干擾物均實(shí)現(xiàn)基線分離，響應(yīng)值也得到明顯提高，表明在此分辨率條件下樣品中的基質(zhì)干擾得到有效消減。圖3為30種激素的提取離子色譜圖。

圖3 30種激素化合物的提取離子色譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms of 30 hormone compounds

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價

魚肉基質(zhì)復(fù)雜，可能存在基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，故進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評價。如表2所示，在多寶魚中， 30種激素的基質(zhì)效應(yīng)均在80%～120%范圍內(nèi)，即基質(zhì)效應(yīng)不明顯；在鱖魚中，表睪酮、倍氯米松、潑尼松表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；在烏魚中，美雄酮、可的松表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，氫化可的松表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；在草魚中，表睪酮、美雄酮、氟米松、氟米龍、潑尼松表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。為獲得更加準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，本實(shí)驗在定量環(huán)節(jié)通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線消除或減弱基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表2 30種激素的線性關(guān)系、基質(zhì)效應(yīng)、LOD和LOQTable 2 Linear relationships, matrix effects, limits of detection and limits of quantification of 30 hormones

續(xù)表2

2.5 方法的線性關(guān)系、基質(zhì)效應(yīng)、LOD和LOQ

將魚肉空白提取液配制30種化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在已優(yōu)化的分析條件下進(jìn)行測定。以目標(biāo)化合物色譜峰面積（Y）及其對應(yīng)組分質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算獲得待測物質(zhì)的線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)（r），分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計算出方法的LOD和LOQ。由表2可知，魚肉中30種激素在0.5～100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.995 0。方法的LOD和LOQ依次為0.2～1.0 μg/kg和0.5～2.0 μg/kg，均滿足實(shí)驗需求。

2.6 回收率和精密度結(jié)果

向多寶魚、鱖魚、烏魚、草魚的空白樣品中分別添加30種激素的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成陽性樣品，按照已建立的方法，在1、5 倍和10 倍LOQ三個添加水平下各重復(fù)測定6 次，求解得到回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3。添加水平在1～10 倍LOQ時，30種激素在多寶魚基質(zhì)中的回收率為72.1%～103.2%，RSD為2.6%～9.4%；在鱖魚基質(zhì)中的回收率為69.7%～101.1%，RSD為2.3%～8.9%；在烏魚基質(zhì)中的回收率為69.9%～99.3%，RSD為3.2%～9.2%；在草魚基質(zhì)中的回收率為69.9%～103.2%，RSD為2.8%～9.1%。表明本研究建立的方法準(zhǔn)確度和精密度均滿足實(shí)驗需求。

表3 30種激素在魚肉中的回收率和RSD（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 30 hormones spiked in fish (n = 6)%

2.7 實(shí)際樣品篩查

應(yīng)用本研究建立的方法對36 批次市售魚肉樣品（多寶魚、鱖魚、烏魚和草魚各9 批次）進(jìn)行檢測，樣品經(jīng)前處理和上機(jī)測試后，利用TraceFinder軟件中已建數(shù)據(jù)庫對樣品中30種激素進(jìn)行多目標(biāo)定性篩查，可疑樣品結(jié)合HCD二級特征碎片離子確證，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。1 批次樣品草魚中檢出氫化可的松 （3.9 μg/kg），其余樣品均未檢出30種激素藥物。各項指標(biāo)均達(dá)到篩檢要求，表明結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗以4種魚肉作為研究對象，建立多目標(biāo)快速篩查和確證魚肉中30種蛋白同化激素及糖皮質(zhì)激素的分析方法，樣品經(jīng)80%乙腈-0.2%甲酸溶液提取后離心，上清液經(jīng)Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化后過濾膜上機(jī)測試。30種激素的添加回收率為69.7%～103.2%，RSD為2.3%～9.4%；LOD為0.2～1.0 μg/kg，LOQ為0.5～2.0 μg/kg。 該方法優(yōu)勢明顯，更加快捷高效、準(zhǔn)確可靠，能滿足日常魚肉樣品中30種蛋白同化激素及糖皮質(zhì)激素快速篩查的需要。