牛燦杰，徐騰洋，張水鋒，趙淑娟，朱 帥，鄭仕劍，黃潤韜，盛華棟,*

（1.浙江方圓檢測集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310018；2.浙江省食品安全重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 310018；3.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310012）

水產(chǎn)品味道鮮美，營養(yǎng)價值高，是消費(fèi)者喜愛的食品之一，然而由于水產(chǎn)品富含水分，在流通過程中，易發(fā)生污菌腐敗[1]，抑菌防腐劑的添加時有發(fā)生。水產(chǎn)品中常用抑菌防腐劑有殼聚糖[2-5]、山梨酸鉀[6-7]、乳酸鏈球菌素[8-9]、雙乙酸鈉[7,10]。關(guān)于水產(chǎn)品中雙乙酸鈉的防腐保鮮效果研究較多[7,10-12]，研究表明雙乙酸鈉在水產(chǎn)品防腐方面具有廣闊的應(yīng)用前景及發(fā)展?jié)摿13-15]。甲醛因其具有防腐、定型、改善外觀的效果，有可能被非法添加在水產(chǎn)品中，該問題越來越受到人們重視[16]。目前，我國針對水產(chǎn)品中雙乙酸鈉及甲醛的限量標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法仍比較匱乏。GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》只規(guī)定了熟制水產(chǎn)品中雙乙酸鈉的限量，禁止使用甲醛作為水產(chǎn)品添加劑。我國針對水產(chǎn)品中雙乙酸鈉及甲醛的檢測方法分別為GB 5009.277—2016《食品中雙乙酸鈉的測定》、SC/T 3025—2006《水產(chǎn)品中甲醛的測定》，均經(jīng)酸化后采用傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取，甲醛還需經(jīng)過復(fù)雜耗時的衍生化反應(yīng)及反萃取過程進(jìn)行檢測，采用分光光度法時靈敏度、準(zhǔn)確度較低，且易受干擾造成假陽性結(jié)果[16]，不利于大批量樣品的快速定性定量檢測。食品中雙乙酸鈉的檢測方法有高效液相色譜法[17-18]和離子色譜法[19]，前處理方法主要有直接浸提法[18]、水蒸氣蒸餾法[17]、固相萃取法[20]；采用直接浸提法，由于雙乙酸鈉酸化后產(chǎn)物乙酸吸收波長短，在反相色譜柱（如C18色譜柱）上吸附能力弱，基質(zhì)復(fù)雜時干擾較嚴(yán)重，不適用于水產(chǎn)品中雙乙酸鈉的檢測；采用固相萃取方法，步驟繁瑣且在一定程度上增加了檢測成本；采用傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取，耗時、操作復(fù)雜，穩(wěn)定性差且回收率低。針對水產(chǎn)品中甲醛檢測方法的研究報道較多，主要有直接浸提柱前衍生法[21]及水蒸氣蒸餾提取柱前衍生法[22]；采用直接浸提法，主要提取水產(chǎn)品中的游離態(tài)甲醛，不能提取結(jié)合態(tài)甲醛，由于水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)，易形成可逆結(jié)合態(tài)蛋白質(zhì)-甲醛復(fù)合物，所以采用直接浸提法提取時甲醛的添加回收率不佳[23]；水蒸氣蒸餾能提取游離態(tài)甲醛和可逆結(jié)合態(tài)甲醛，適用于水產(chǎn)品中甲醛的提取，但傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾回收率不高。

目前，針對水產(chǎn)品中游離態(tài)及可逆結(jié)合態(tài)甲醛同時提取并在線衍生的方法鮮見報道，水產(chǎn)品中甲醛和雙乙酸鈉同時檢測的方法也鮮見報道，但水產(chǎn)品中添加這兩種防腐劑的可能性較大，而相關(guān)檢測方法比較匱乏，因此開發(fā)快速、簡便、高效，適用于水產(chǎn)品基質(zhì)且可大通量檢測的方法具有十分重要的意義。本實驗探究采用凱氏定氮儀，同時進(jìn)行水產(chǎn)品中雙乙酸鈉及甲醛的水蒸氣蒸餾提取的前處理方法，并對水產(chǎn)品中甲醛在線衍生方法進(jìn)行優(yōu)化，減少有機(jī)溶劑反萃取步驟，建立采用雙三元高效液相色譜同時快速檢測水產(chǎn)品中甲醛和雙乙酸鈉的方法，旨在為保障消費(fèi)者食品安全，滿足水產(chǎn)品風(fēng)險監(jiān)測需要提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

66 批次水產(chǎn)品：帶魚5 批次，黃姑魚5 批次、大黃魚4 批次、梅魚2 批次、鯧魚3 批次、章跳魚2 批次、龍頭魚7 批次、白果魚3 批次、小黃魚4 批次、多寶魚2 批次，均為冷凍狀態(tài)；鯽魚8 批次，大閘蟹4 批次、石蟹3 批次、明蝦3 批次、沼蝦6 批次、梭子蟹2 批次，均為鮮活狀態(tài)；三文魚3 批次，為冰鮮狀態(tài)；以上主要購自流通環(huán)節(jié)。

甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL） 環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所；雙乙酸鈉（純度98.0%） 日本TCI公司；2,4-二硝基苯肼（分析純） 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；磷酸（純度≥85%，分析純） 杭州雙林化工試劑廠；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國天地有限公司；實驗所用的水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000 DGLC雙三元高效液相色譜儀（配有兩臺二極管陣列檢測器及變色龍Chromeleon7色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Thermo Fisher公司；KN680凱氏定氮儀 濟(jì)南阿爾瓦有限公司；AH-30全自動均質(zhì)器 福建?？萍瘓F(tuán)股份有限公司；SK6200LHC超聲儀 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

2,4-二硝基苯肼溶液（衍生液）：稱取100 mg 2,4-二硝基苯肼溶解于50 mL乙腈-乙酸（4∶1，V/V）混合溶液。

4 mol/L磷酸溶液：在500 mL水中加入246 mL磷酸，混合后加水定容至1 000 mL，混勻。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別取適量甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液；稱取適量雙乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，配制成10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別取適量雙乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液于凱氏定氮儀配套的消解管中，按實驗方法和凱氏定氮儀設(shè)定程序進(jìn)行水蒸氣蒸餾，制得質(zhì)量濃度為10、20、50、100、150、200 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10 g樣品（取肌肉等可食部分）于具塞離心管中，加入20 mL超純水，經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)均勻，于超聲儀中超聲提取10 min，用約10 mL水少量多次轉(zhuǎn)移至凱氏定氮儀配套的消解管中，加入5 mL 4 mol/L磷酸溶液，進(jìn)行水蒸氣蒸餾，接收冷凝后的蒸餾液，過膜，上機(jī)。

1.3.4 色譜條件

左泵系統(tǒng)：色譜柱：菲羅門Uranus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相：100% 1.5 g/L磷酸二氫銨溶液（用1 mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0）；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長214 nm。

右泵系統(tǒng)：色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相：甲醇-水（60∶40，V/V）；流速1 mL/min；在線衍生程序：取衍生液10 μL，樣品溶液10 μL，充分混勻，反應(yīng)4 min；檢測波長355 nm。

1.4 圖譜處理及數(shù)據(jù)分析

采用UltiMate 3000 DGLC雙三元高效液相色譜儀的變色龍Chromeleon7色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及Excel軟件進(jìn)行圖譜分析及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 在線衍生條件選擇

參考文獻(xiàn)[24-27]，在已有研究基礎(chǔ)上，結(jié)合實際檢測樣品及儀器條件，對衍生液體積、衍生時間進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 衍生液體積選擇

分別取10 μL 10 mg/L甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液與5、10、20、30、40、50 μL衍生液進(jìn)行在線衍生4 min，色譜圖如圖1所示，當(dāng)衍生液的取樣量為30、40、50 μL時，所得目標(biāo)峰峰形逐漸變差，不利于準(zhǔn)確定量，可能是由于衍生液過量造成色譜柱超載。衍生液體積為5、10、20 μL時，所得目標(biāo)峰峰形良好。由于衍生液體積越大對色譜柱損傷越嚴(yán)重，因此，兼顧靈敏度及保護(hù)色譜柱的原則，選擇衍生液的體積為10 μL。

圖1 不同衍生液體積所得甲醛衍生物色譜圖Fig. 1 Chromatograms of formaldehyde derivatives with different volumes of derivatization agent

2.1.2 衍生反應(yīng)時間的選擇

設(shè)定衍生程序為：樣液10 μL，衍生液10 μL，改變在線衍生時間1、2、3、4、5、6 min，連續(xù)進(jìn)1 mg/L甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液6 針，測得相應(yīng)峰面積值的平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果如圖2所示，就峰面積平均值而言，衍生時間由1 min增長時至2 min時，峰面積有所增加，2～5 min時，峰面積值基本穩(wěn)定，這與呂春華等[26]的研究相符合；由峰面積的RSD可得，1～4 min時，隨衍生時間的延長，峰面積的RSD逐漸減小，4、5、6 min峰面積的RSD改變不大，可能是隨著衍生時間延長，反應(yīng)趨于更加完全穩(wěn)定，因此兼顧節(jié)約時間及保證穩(wěn)定性的原則，衍生時間選擇為4 min。

圖2 不同衍生時間對應(yīng)峰面積平均值及峰面積RSD（n=6）Fig. 2 Average peak area and RSD of peak area as a function of derivatization time (n = 6)

2.2 目標(biāo)物餾出液體積確定

取空白鯽魚試樣10 g、雙乙酸鈉添加量1.0 g/kg、甲醛添加量0.05 g/kg，樣品經(jīng)磷酸酸化后經(jīng)過水蒸氣蒸餾，冷凝管冷卻后，接收餾出液，每個餾出體積平行6 組實驗，對不同餾出液體積對應(yīng)的回收率進(jìn)行考察，由圖3可知，甲醛及雙乙酸鈉的回收率隨餾出體積的增加而增大，餾出液體積為25 mL時，雙乙酸鈉及甲醛的平均回收率分別為20.6%（RSD=3.43%，n=6）和34.5%（RSD=4.14%，n=6）；餾出液體積為50 mL時，雙乙酸鈉及甲醛的平均回收率分別為44.5%（RSD=3.21%，n=6）和54.3%（RSD=3.28%，n=6）；餾出液體積為100 mL時，雙乙酸鈉及甲醛的平均回收率分別為75.5%（RSD=3.36%，n=6）和74.1%（RSD=2.44%，n=6）；餾出液體積為200 mL時，雙乙酸鈉及甲醛的平均回收率分別為92.1%（RSD=2.16%，n=6）和82.8%（RSD=1.95%，n=6）；餾出液體積為250 mL時，雙乙酸鈉及甲醛的平均回收率分別為99.0%（RSD=3.11%，n=6）和83.5%（RSD=1.91%，n=6）；其中，餾出液體積由200 mL增加至250 mL時，甲醛回收率基本一致，雙乙酸鈉回收率由92.1%增加至99.0%，餾出時間延長約為1 min，兼顧雙乙酸鈉及甲醛的回收率，本實驗餾出液體積為250 mL。

圖3 不同餾出液體積對回收率的影響（n=6）Fig. 3 Effect of different distillate volumes on recoveries of formaldehyde and sodium diacetate (n = 6)

2.3 波長選擇及色譜行為

分別取100 mg/L雙乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液及10 mg/L甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.4節(jié)色譜條件進(jìn)樣，所得色譜圖如 圖4所示。在190～400 nm波長處進(jìn)行掃描，所得光譜見圖5、6。由圖5可得，雙乙酸鈉在200 nm左右有最大吸收，但200 nm左右的雜質(zhì)吸收峰較多，而在214 nm處目標(biāo)物也有較大吸收峰，同時雜質(zhì)吸收峰較小，所以實驗選擇214 nm作為檢測波長；甲醛在線衍生所得衍生物的光譜圖（圖6）表明甲醛衍生物在355 nm具有最大吸收，因此檢測波長選定為355 nm。這與 GB/T 2116—2007《小麥粉與大米粉及其制品中甲醛次硫酸氫鈉含量的測定》中，甲醛與2,4-二硝基苯肼衍生物的光譜圖一致。

圖4 雙乙酸鈉和甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig. 4 Chromatograms of sodium diacetate and formaldehyde standard solutions

圖5 雙乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液光譜圖Fig. 5 Ultraviolet absorption spectrum of sodium diacetate standard solution

圖6 甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后光譜圖Fig. 6 Ultraviolet absorption spectrum of formaldehyde standard solution

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限實驗結(jié)果

按照1.3.2節(jié)配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算得到甲醛衍生物、雙乙酸鈉線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為Y=5.660 3X+1.217 5（R2=0.999 9）、Y=0.180 9X+0.146 9（R2=0.999 7），甲醛在0.5～20.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，雙乙酸鈉在10～200 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以3 倍性噪比對應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度為檢出限，折合到樣品中，得甲醛及雙乙酸鈉的檢出限分別為0.5、10 mg/kg。以10 倍性噪比對應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度為定量限，折合到樣品中，得甲醛及雙乙酸鈉的定量限分別為1.5、30 mg/kg。

2.5 方法回收率實驗結(jié)果

按優(yōu)化好的實驗條件分別向鯽魚及多寶魚空白樣品中加入低、中、高3個水平的甲醛及雙乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)董靚靚等[23]對40種水產(chǎn)樣品中甲醛含量的調(diào)查結(jié)果，選定甲醛的添加量為10、20、50 mg/kg；由于目前GB 2760—2014中僅對熟制水產(chǎn)品中雙乙酸鈉的限量為1 000 mg/kg，暫根據(jù)此，選定雙乙酸鈉的添加量為200、500、1 000 mg/kg。每個質(zhì)量濃度重復(fù)6 次平行，進(jìn)行批內(nèi)精密度實驗及批間精密度實驗，結(jié)果見表1、2。批內(nèi)精密度實驗中，甲醛回收率為81.4%～88.3%，RSD為1.73%～2.68%，雙乙酸鈉回收率為91.4%～102.9%，RSD為3.08%～4.16%；批間精密度實驗中，甲醛回收率為80.6%～87.9%，RSD為2.07%～2.72%，雙乙酸鈉回收率為90.8%～105.1%，RSD為3.44%～4.64%，該方法回收率高、精密度好，可滿足水產(chǎn)品中雙乙酸鈉及甲醛同時檢測的要求。

表1 甲醛、雙乙酸鈉回收率及RSD（n=6）（批內(nèi)）Table 1 Recoveries and RSDs of formaldehyde and sodium diacetate for intrabatch repeability (n = 6)

表2 甲醛、雙乙酸鈉回收率及RSD（n=6）（批間）Table 2 Recoveries and RSDs of formaldehyde and sodium diacetate for interbatch repeability (n = 6)

2.6 本方法與現(xiàn)有方法的比較

取2.5節(jié)中鯽魚加標(biāo)樣品，其中甲醛添加量為 20 mg/kg，雙乙酸鈉添加量為500 mg/kg，分別依據(jù)本實驗建立方法、SC/T 3025—2006、GB 5009.277—2016進(jìn)行檢測，重復(fù)6 次平行實驗，所得數(shù)據(jù)見表3，由表3發(fā)現(xiàn)，就檢測項目而言，本方法可同時檢測水產(chǎn)品中甲醛及雙乙酸鈉含量，其余兩方法只能完成一個項目的檢測；就測得值而言，本方法中甲醛及雙乙酸鈉的回收率均高于另外兩方法，更接近于理論值，可能是由于本方法采用凱氏定氮儀，空間更加密閉，空間體積更小，提高了蒸餾回收率，且本方法采用在線衍生程序，蒸餾提取后直接進(jìn)高效液相色譜儀檢測，減少了有機(jī)溶劑反萃取步驟，降低了過程損失；就檢測時間而言，采用本方法25 min可以同時完成甲醛及雙乙酸鈉的檢測，快速高效。分別采用SC/T 3025—2006、GB 5009.277—2016測定水產(chǎn)品中的甲醛及雙乙酸鈉時，僅單獨(dú)檢測一個樣品中的雙乙酸鈉及甲醛需要150 min，且實驗初需要搭建蒸餾裝置，雙乙酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)溶液也需經(jīng)過蒸餾，平均到每個樣品的時間遠(yuǎn)超150 min，不利于大批量樣品檢測，不能滿足風(fēng)險監(jiān)測快速抽檢的需要。

表3 本實驗建立方法與現(xiàn)有方法對比Table 3 Comparison between DGLC and other methods

2.7 實際樣品檢測結(jié)果

結(jié)合本研究方法對66 批次水產(chǎn)品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5 批次水產(chǎn)品僅檢測出雙乙酸鈉，分別為大黃魚、帶魚、白果魚、沼蝦，檢出結(jié)果范圍為0.189～2.30 g/kg； 有7 批次水產(chǎn)品僅檢測出甲醛，分別為石蟹、龍頭魚、帶魚、梅魚，檢出結(jié)果范圍為3.24～78.4 mg/kg；有2 批次水產(chǎn)品同時檢測出雙乙酸鈉和甲醛，結(jié)果見表4。 結(jié)合實際樣品檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）水產(chǎn)品中雙乙酸鈉及甲醛的檢出率分別為10.6%、13.6%，檢出率較高；2）結(jié)合魏建華[28]、張璇[29]等的研究，龍頭魚中檢出的甲醛含量低于報道中其平均天然本底含量，推測檢出的甲醛可能是龍頭魚天然含有，還有可能是在貯存過程中自身產(chǎn)生，這就需要建立快速檢測方法積累大量研究數(shù)據(jù)以判定是否為人為添加；3）水產(chǎn)品中雙乙酸鈉的檢測以測定乙酸含量進(jìn)行計算，水產(chǎn)品中乙酸本底值的調(diào)查研究目前鮮見報道，仍需要大量研究數(shù)據(jù)以建立及完善相關(guān)判定標(biāo)準(zhǔn)。大量研究數(shù)據(jù)的積累需要快速、穩(wěn)定、可用于大通量檢測的分析方法。

表4 陽性樣品檢出信息（n=3）Table 4 Results of detection of positive samples (n = 3)

3 結(jié) 論

本實驗研究采用凱氏定氮蒸餾裝置同時提取水產(chǎn)品中雙乙酸鈉、游離態(tài)及結(jié)合態(tài)甲醛的前處理方法，并對甲醛在線衍生方法進(jìn)行優(yōu)化，建立了采用雙三元高效液相色譜同時檢測水產(chǎn)品中甲醛及雙乙酸鈉的方法，縮短了檢測時間，簡化了操作步驟，減少了有機(jī)試劑的使用，自動化程度高，方法回收率較現(xiàn)有方法高，檢出限較現(xiàn)有方法低，利于大批量水產(chǎn)品中甲醛及雙乙酸鈉的快速檢測，為國家建立食品安全風(fēng)險評估制度提供了基礎(chǔ)技術(shù)參考。對66 批次水產(chǎn)品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)了有檢出樣品，但仍舊無法進(jìn)行判定，因此，建立可行的檢測方法是基礎(chǔ)，采用檢測方法建立并逐步完善水產(chǎn)品中甲醛本底、乙酸本底含量數(shù)據(jù)庫，為相關(guān)判定標(biāo)準(zhǔn)的建立積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以利于監(jiān)管部門監(jiān)管，從而保障食品安全。