田原，萬妍，徐玲，張向穎，任鋒，吳劍

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院北京肝病研究所，北京100069；2.首都體育學(xué)院運動科學(xué)與健康學(xué)院，北京100191)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染可引發(fā)肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，給社會造成巨大的經(jīng)濟壓力[1]。HBV不能被治愈的關(guān)鍵因素在于共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，它是病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄的模板[2]。目前HBV cccDNA的檢測方法主要有Southern blot、滾環(huán)擴增(rolling circle amplification, RCA)、熒光定量PCR(Real-time PCR, qPCR)和巢式PCR等，均存在靈敏度低、操作繁瑣和成本較高等缺點[3-4]。因此，需要建立一種更有效的HBV cccDNA檢測方法。

近年來，規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas)被應(yīng)用于分子診斷[5]。如Cas13a蛋白具有“附帶切割”活性，不僅能在CRISPR RNA(crRNA)的引導(dǎo)下切割靶標(biāo)核酸，還能切割附近的非靶標(biāo)核酸[6]。研究人員利用此特性開發(fā)了SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unLOCKing)等檢測方法，具有較高的靈敏度[7]。通過本課題組前期的實驗研究，筆者利用RCA、PCR和CRISPR/Cas13a技術(shù)建立了具有高靈敏度檢測HBV cccDNA的方法(命名為CRISPR-HBV cccDNA方法)。本研究擬利用CRISPR-HBV cccDNA、數(shù)字PCR(ddPCR)和熒光定量PCR法對HBV cccDNA質(zhì)粒及臨床樣本進(jìn)行檢測及對比，進(jìn)而評價CRISPR-HBV cccDNA方法的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2017年6月至2020年10月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院就診的25例HBV感染患者以及5例非HBV感染患者的肝組織樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：血液中檢測出HBV DNA。排除標(biāo)準(zhǔn)：無HBV感染史，且血液中未檢測出HBV DNA。所有患者均未經(jīng)過治療。其中HBV感染患者年齡為(45±15)歲，非HBV感染患者年齡為(39±11)歲。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批[批準(zhǔn)文號：京佑科倫字(2020)132號]，患者均簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器 質(zhì)粒為本實驗室構(gòu)建的pUC57-HBV質(zhì)粒。LwCas13a蛋白(杭州眾測公司)，RNase抑制劑、T7 RNA聚合酶、rNTP Mix、phi29 DNA聚合酶和HindⅢ內(nèi)切酶(美國NEB 公司)，質(zhì)粒保護(hù)性ATP依賴的DNA酶Plasmid-safe ATP-dependent DNase(美國Lucigen公司)，DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司)，TaqMan Fast Advanced Master Mix(美國Applied Biosystems公司)。 ViiATM7 Real-Time PCR System熒光定量PCR(美國Applied Biosystems公司)，新羿TD-1微滴式數(shù)字PCR儀(北京新羿公司)，NanoDropTMOne/OneC微量 UV-Vis分光光度計(美國賽默飛公司)。

1.3引物和探針設(shè)計 根據(jù)HBV cccDNA與HBV松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)基因結(jié)構(gòu)上的差異，在跨越HBV DNA負(fù)鏈缺口處的相對保守位置設(shè)計引物和探針(表1)，其GenBank序列號為：OM688318.1。RCA引物R1～R8均來自相關(guān)文獻(xiàn)[8]。所有引物和探針序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物及探針序列

1.4HBV cccDNA陽性質(zhì)粒的構(gòu)建 利用HBV cccDNA引物對pUC57-HBV質(zhì)粒進(jìn)行擴增，然后對擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA產(chǎn)物純化試劑盒對目的片段的凝膠進(jìn)行回收，利用回收的目的片段與T載體連接，轉(zhuǎn)入JM109大腸埃希菌中，再將大腸埃希菌置于LB培養(yǎng)基中，在37 ℃孵箱中過夜并進(jìn)行擴增，最后利用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

1.5肝組織HBV cccDNA的制備 先按照DNA提取試劑盒說明書從肝組織中提取總DNA，然后用HindⅢ內(nèi)切酶對總DNA進(jìn)行酶切。HindⅢ酶切體系總體積為50 μL，包括：HindⅢ內(nèi)切酶1 μL，10× NEB Buffer 5 μL，總DNA 10 μL，DEPC水34 μL。反應(yīng)條件：37 ℃水浴60 min。用PSAD酶進(jìn)行消化。PSAD酶切體系總體積為11.7 μL，包括：25 mmol/L ATP 0.8 μL，PSAD(10 U/L)0.4 μL，10× Buffer 2 μL，肝組織DNA產(chǎn)物 8.5 μL。反應(yīng)條件：37 ℃水浴12 h過夜，70 ℃水浴30 min。收集并得到HBV cccDNA產(chǎn)物。

1.6RCA擴增 第一步擴增體系總體積為10 μL，包括：10× Phi29 DNA聚合酶 Buffer 1 μL，引物(R1～R8)4 μL(每個引物0.5 μL)，HBV cccDNA<5 μL(適量)，DEPC水補足至10 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；50 ℃ 15 s；30 ℃ 15 s；20 ℃ 10 min。第二步擴增體系總體積為20 μL，包括：上一步擴增產(chǎn)物10 μL，Phi29 DNA聚合酶1 μL，10× Phi29 DNA聚合酶 Buffer 1 μL，引物(R1～R8)4 μL(每個引物0.5 μL)，Phi29 BSA 1 μL，4× dNTP mix 3 μL。反應(yīng)條件：30 ℃水浴16 h過夜， 65 ℃水浴10 min。

1.7逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及熒光定量PCR檢測 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括：TaqMan Fast Advanced Master Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，探針0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。根據(jù)Ct值判斷結(jié)果：Ct值≤35為陽性，3540為陰性。

1.8數(shù)字PCR檢測 根據(jù)新羿TD-1微滴式數(shù)字PCR儀操作，配置反應(yīng)體系，總體積為30 μL，包括：2×SuperMix 15 μL，上游引物(10 μmol/L)0.6 μL，下游引物(10 μmol/L)0.6 μL，探針(10 μmol/L)0.6 μL，模板3 μL，ddH2O 10.2 μL。反應(yīng)條件：95℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；12 ℃ 5 min。根據(jù)拷貝數(shù)判斷結(jié)果：拷貝數(shù)≥1為陽性，拷貝數(shù)<1為陰性。

1.9CRISPR-Cas13a檢測 配置檢測體系，總體積為25 μL,包括：NTP Mix(2.5 mmol/L)2 μL，RNA酶抑制劑1 μL，LwCas13a蛋白(25 nmol/L)1 μL，T7 RNA聚合酶0.5 μL，MgCl2溶液(10 mmol/L)0.25 μL，HEPES緩沖液(20 mmol/L)0.5 μL，crRNA(2 μmol/L)1.5 μL，熒光報告RNA(2 nmol/L)2.5 μL，無菌/無酶ddH2O 10.75 μL，擴增產(chǎn)物5 μL。其中，crRNA靶位點序列為：GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACAACUUUUUCACCUCUGCCUAAUCAUCUC。檢測條件：37 ℃ 60 min。檢測并判讀60 min時的熒光值。

1.10靈敏度比對試驗 利用微量 UV-Vis 分光光度計對構(gòu)建的HBV cccDNA陽性質(zhì)粒以及1例HBV陽性臨床肝組織樣本制備的HBV cccDNA進(jìn)行濃度測量，根據(jù)拷貝數(shù)計算公式得到拷貝數(shù)，然后按照濃度梯度稀釋為104、103、102、101、100copies/μL。再利用數(shù)字PCR、熒光定量PCR和CRISPR-HBV cccDNA方法進(jìn)行靈敏度檢測比對及結(jié)果判讀，試驗重復(fù)3次。

1.11臨床樣本檢出率的對比試驗 提取25例HBV感染患者和5例非HBV感染患者肝組織樣本的總DNA，按照HBV cccDNA的制備方法進(jìn)行檢測。再利用數(shù)字PCR、熒光定量PCR和CRISPR-HBV cccDNA方法進(jìn)行檢出率的比對及結(jié)果判讀。試驗重復(fù)3次。

1.12統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。HBV cccDNA陽性質(zhì)粒和陽性樣本的靈敏度比對數(shù)據(jù)使用t檢驗，計數(shù)資料以例數(shù)(n)或百分率(%)表示，不同方法陽性率比較采用配對χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CRISPR-HBV cccDNA檢測方法的構(gòu)建流程 如圖1所示，從樣本中提取總DNA后，經(jīng)過HindⅢ內(nèi)切酶和PSAD酶消化，先利用RCA引物進(jìn)行擴增，然后通過帶有T7啟動子的PCR引物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄擴增，使雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄為單鏈RNA，再使用CRISPR-Cas13a體系對其進(jìn)行檢測，當(dāng)特異性的crRNA識別到HBV cccDNA靶序列時，便會激發(fā)Cas13a蛋白活性，剪切熒光報告探針，從而發(fā)出熒光信號。

圖1 CRISPR-HBV cccDNA檢測方法示意圖

2.2HBV cccDNA陽性質(zhì)粒靈敏度對比試驗 本研究建立的CRISPR-HBV cccDNA方法檢測100copies/μL的熒光值(242 402.67±46 084.99)與陰性對照(NC)的熒光值(71 738.63±11 030.72)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.093，P<0.01)，確定最低檢測限為1 copies/μL。熒光定量PCR檢測101copies/μL的Ct值(38.4±0.4)與NC(41.1±0.5)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.051，P<0.01)，確定最低檢測限為101copies/μL。數(shù)字PCR檢測101copies/μL的拷貝數(shù)(15.28+3.85)與NC(2.30±1.24)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.170，P<0.01)，確定最低檢測限為101copies/μL。結(jié)果見表2。

表2 3種方法檢測HBV cccDNA陽性質(zhì)粒的結(jié)果

2.3陽性樣本靈敏度對比試驗 本研究建立的CRISPR-HBV cccDNA方法檢測100copies/μL的熒光值(39 033.70±446.53)與NC(3 600.32±161.34)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=105.5，P<0.0001)，確定最低檢測限為1 copies/μL。qPCR檢測101copies/μL的Ct值(34.78±0.65)與NC(40.35±0.59)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.853，P<0.001)，確定最低檢測限為10 copies/μL。ddPCR檢測100copies/μL的拷貝數(shù)(6.50±0.81)與NC(3.70±0.72)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.674，P<0.05)，確定最低檢測限為1 copies/μL。結(jié)果見表3。

表3 3種方法檢測HBV cccDNA陽性樣本靈敏度的對比

2.4陽性樣本特異性驗證 標(biāo)記了地高辛的HBV cccDNA探針和HBV rcDNA探針以及其對應(yīng)的地高辛標(biāo)記的對照組DNA均可以被檢出，見圖2A和B。當(dāng)檢測3個HBV cccDNA陽性細(xì)胞樣本時，HBV cccDNA被檢出，而HBV rcDNA未被檢出，見圖2C。

圖2 Southern blot檢測陽性樣本的特異性

2.5臨床樣本檢出率對比試驗 25例HBV感染患者中，ddPCR法檢測出16例,陽性率為64%(16/25)，qPCR方法檢測出12例，陽性率為48%(12/25)，CRISPR-HBV cccDNA方法檢測出20例，陽性率為80%(20/25)。ddPCR法與CRISPR-HBV cccDNA方法的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012 7)。5例非HBV感染患者中，ddPCR、qPCR和CRISPR-HBV cccDNA方法均未檢出。見表4。

表4 3種方法檢測臨床樣本的結(jié)果比較

3 討論

在前期的研究中，筆者利用HindⅢ內(nèi)切酶和PSAD酶分別對肝臟提取的DNA進(jìn)行消化，然后依據(jù)rcDNA和cccDNA的結(jié)構(gòu)差異，設(shè)計特異性擴增HBV cccDNA的引物，對酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)擴增(RCA)和PCR擴增，并通過篩選靶向HBV cccDNA基因的crRNA序列，建立了基于CRISPR-Cas13a技術(shù)的HBV cccDNA檢測新方法(命名為CRISPR-HBV cccDNA方法)。

Zhong等[9]利用RCA方法與qPCR方法相結(jié)合，顯著提高了HBV cccDNA檢測的靈敏度。另有學(xué)者利用CRISPR-Cas13a技術(shù)對新冠病毒、埃博拉病毒和流感病毒等進(jìn)行了高靈敏度和高特異性地檢測[10-11]。 本研究利用RCA方法和qPCR方法與CRISPR-Cas13a技術(shù)相結(jié)合，建立的CRISPR-HBV cccDNA檢測方法對HBV cccDNA陽性質(zhì)粒的檢測靈敏度為1 copies/μL，顯著高于ddPCR(101copies/μL)和qPCR(101copies/μL)方法；對陽性樣本檢測的檢測靈敏度也為1 copies/μL，與ddPCR方法相同，亦高于qPCR(101copies/μL)方法。此外，本研究對于25例HBV感染的臨床肝組織樣本的檢測結(jié)果表明，建立的CRISPR-HBV cccDNA方法檢出陽性率為80%，均明顯高于ddPCR(64%)和qPCR(48%)方法。

綜上所述，本研究建立的CRISPR-HBV cccDNA方法，能對HBV感染患者肝組織的HBV cccDNA進(jìn)行高靈敏度的檢測，為評價HBV治療效果，更好地指導(dǎo)臨床用藥提供了新的方法。

致謝：田原、萬妍負(fù)責(zé)收集資料，開展實驗；徐玲、張向穎負(fù)責(zé)分析數(shù)據(jù)，撰寫文章；任鋒、吳劍負(fù)責(zé)提供寫作思路、指導(dǎo)并最終定稿。