魏志英，楊軼慧，沈敏娜，周琰，王晨，張春燕，王蓓麗，郭瑋

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科，福建廈門361015)

在全球范圍內(nèi)，不孕不育的患病率正逐年上升，我國最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，人群不孕不育癥的患病率為25%[1]。染色體異常是導(dǎo)致不孕不育的重要因素之一，外周血染色體核型分析在明確遺傳性疾病病因、提供適當(dāng)?shù)倪z傳咨詢和臨床診療方案以及預(yù)防遺傳性疾病中都具有重要的意義[2]。因此，對不孕不育人群進行染色體核型分析有助于疾病的早期診斷以及為后續(xù)的輔助生殖方案選擇提供實驗依據(jù)。本研究回顧性分析了復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診的5 410例優(yōu)生咨詢者的染色體核型結(jié)果，旨在確定優(yōu)生咨詢?nèi)巳褐谐Ｒ姷娜旧w異常分類，從而提供精準(zhǔn)的遺傳咨詢以及生育指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2016年2月至2021年8月于上海市復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院輔助生殖門診就診的優(yōu)生咨詢者5 410例，其中男性2 746例，女性2 664例，年齡10～76歲，中位年齡為39.5歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有不孕不育、少弱精癥、無精癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、原發(fā)或繼發(fā)性閉經(jīng)等[3]；(2)一般優(yōu)生咨詢者；(3)無放射性物質(zhì)接觸史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有放射性物質(zhì)接觸史；(2)臨床資料不全者。

1.2主要儀器及試劑 外周血淋巴細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、吉姆薩染液(上海樂辰生物公司)，Metasystems Ikaros染色體核型分析系統(tǒng)(德國Zeiss公司)。

1.3標(biāo)本采集 所有患者于就診時在無菌條件下常規(guī)采集3 mL靜脈血，置于含有肝素鈉抗凝劑的采血管內(nèi)，4 ℃保存并于當(dāng)日送檢。

1.4染色體核型分析

1.4.1細胞培養(yǎng) 無菌條件下，在生物安全柜內(nèi)取0.5 mL全血接種于培養(yǎng)基內(nèi)，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)68 h。

1.4.2收獲制片 培養(yǎng)基內(nèi)加入75 μL秋水仙素(20 μg/mL)，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，置于離心機中1 500 r/min離心10 min，用低滲液溫育10 min，再用甲醇和乙酸3∶1混合成的固定液進行固定制片，每份樣本制片2張，置于80 ℃干燥箱內(nèi)烘干2 h。

1.4.3顯帶與染色 玻片使用2.5 g/L胰蛋白酶消化25 s，經(jīng)生理鹽水和純凈水沖洗之后，置于吉姆薩染液中染色3 min，顯微鏡下觀察。結(jié)果按《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2016)》[4]進行描述和診斷并計算其嵌合比例，以比例≥3%即可報告為嵌合。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad prism 9統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以頻數(shù)和率[n(%)]描述。組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.15 410例遺傳咨詢者染色體核型結(jié)果 5 410例遺傳咨詢者共檢出異常核型374例，檢出率為6.9%(374/5 410)。其中男性檢出194例，異常率為7.1%(194/2 746)，女性檢出180例，異常率為6.8%(180/2 664),兩者間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.199 4，P>0.05)。在374例異常染色體核型的患者中，染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常率分別為14.97%(56/374)和13.10%(49/374)，嵌合體異常率為18.18%(68/374)，性反轉(zhuǎn)異常率為0.8%(3/374)，均低于染色體多態(tài)性改變的52.94%(198/374)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.23，P<0.05)。見表1。

表1 異常染色體核型的臨床表型分布

2.2常染色體異常核型結(jié)果 經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，常染色體核型42例，占異常核型比為11.5%(43/374)；其中平衡易位22例，占比為5.88%(22/374)；羅氏易位7例，占比為1.87%(7/374)；倒位10例，占異常核型比為3.74%；染色體片段的缺失或增加3例，占比為0.8%。

2.3性染色體異常核型結(jié)果 性染色體異常占比為34.76%(130/374)，其中性染色體數(shù)目異常52例，包括47,XXY克氏綜合征42例，超雄綜合征4例，特納綜合征6例；性反轉(zhuǎn)3例，性染色體嵌合68例，占異常核型比為18.18%；性染色體的結(jié)構(gòu)異常7例，占異常核型比為1.87%。

2.4染色體多態(tài)性核型結(jié)果 染色體多態(tài)性198例，占所有異常核型比為52.94%，其中1、9、16號染色體次縊痕增加51例，DG組隨體改變55例，Y染色體次縊痕改變18例，9號染色體倒位66例。

3 討論

本研究納入的5 410例遺傳咨詢者中染色體異常率為6.91%(374/5 410)，其中染色體多態(tài)性占比最高，占染色體畸變總數(shù)的52.94%(198/374)。已有研究[5]評估了中國患者染色體多態(tài)性變異與不孕不育、不明原因反復(fù)流產(chǎn)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)女性的近端著絲粒多態(tài)性變異與不孕不育、不明原因反復(fù)流產(chǎn)存在潛在關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)的染色體多態(tài)性變異大多表現(xiàn)為不孕不育，這也提示在臨床遺傳咨詢當(dāng)中應(yīng)重視染色體多態(tài)性。在本次實驗中，平衡易位總檢出率為7.75%(29/374)，涉及所有染色體。平衡易位和倒位攜帶者是產(chǎn)前診斷的指征，夫婦可能會因為流產(chǎn)風(fēng)險而拒絕侵入性產(chǎn)前診斷，該類人群對于尋求針對平衡易位的非侵入性的產(chǎn)前檢測有強烈的需求[6]，這也將是未來的研究方向。對于有不孕不育、反復(fù)流產(chǎn)、不良孕產(chǎn)史的患者進行染色體核型分析時給予合適的遺傳咨詢是很有必要的。

本研究檢出性染色體異常130例，性染色體嵌合檢出率為18.18%(68/374)。筆者認為這可能與本研究所采用的分析細胞的計數(shù)規(guī)則有關(guān)，本研究的計數(shù)規(guī)則為：對兩種細胞系嵌合計數(shù)50個，當(dāng)一種細胞系比例超過3%則計入嵌合。對3種細胞系嵌合計數(shù)100個，其中兩種細胞系計數(shù)超過5%則計入嵌合。Tuke等[7]認為具有45,X細胞系的婦女可能并不需要額外的干預(yù)措施，在大多數(shù)情況下，當(dāng)46,XX細胞系超過20%時，血液中存在的45,X細胞系不會對生殖壽命或生育能力產(chǎn)生不利影響。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了3例嵌合型的標(biāo)記染色體。其中1例46,X,+mar[30]/45,X[20]的社會性別為女性，因生育調(diào)查而就診，B超顯示無子宮和卵巢。1例46,X,+mar[33]/45,X[17]的社會性別為女性，因原發(fā)性閉經(jīng)而就診，B超顯示小子宮和卵巢囊腫。1例46,X,del(Y)(q11.23)[41]/46,X,+mar[9]的社會性別為男性，表現(xiàn)為無精癥。有學(xué)者報道在2例男性兒童中45,X/46,X,+mar嵌合型的過表型為身材矮小且伴有性腺發(fā)育落后等[8]。另有學(xué)者[9]證實，低通量的基因組測序能夠以較高的診斷率和分辨率鑒定相關(guān)的染色體異常，更能發(fā)現(xiàn)一些隱匿性的染色體異常?；蚪M測序提供的染色體異常的精確信息可以為患者提供個性化的妊娠方案和遺傳咨詢。在本研究中，筆者認為這3個案例還需進一步進行分子生物學(xué)診斷以明確其來源，從而為患者提供準(zhǔn)確的遺傳咨詢。

綜上所述，隨著目前二代測序的廣泛應(yīng)用，對于微缺失和微重復(fù)，必要時筆者建議聯(lián)合低深度全基因組測序技術(shù)或者染色體微陣列分析技術(shù)進行診斷，從而增加染色體病的檢出率[10]，降低出生缺陷兒的發(fā)生，從而達到優(yōu)生優(yōu)育的目的。