秦建品，許詣，沈文婷，趙夢

(湖北文理學院附屬醫(yī)院，襄陽市中心醫(yī)院兒科，湖北襄陽 441021)

支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前其具體的發(fā)病機制尚未完全明確，闡明支氣管哮喘發(fā)病機制對改善其預后具有重要意義[1]。研究表明，微小RNA(microRNAs，miRNAs)通過調(diào)控靶基因，參與支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，并證實miR-155、miR-21與哮喘發(fā)生密切相關(guān)[2]。miR-21可通過調(diào)控靶基因活化轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/ Smad信號通路，促進哮喘小鼠的氣道重塑[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在支氣管哮喘中呈異常表達，且與炎癥因子水平有關(guān)，并可用于診斷支氣管哮喘[4]。新近研究顯示，在嚴重哮喘中癌癥易感候選基因7(cancer susceptibility candidate 7，CASC7)通過靶向miR-21，抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路，增加皮質(zhì)類固醇的敏感性[5]。目前miR-21、LncRNACASC7在支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血中的水平變化與病情嚴重程度以及對疾病診斷價值尚無明確研究。本研究旨在檢測支氣管哮喘急性發(fā)作期、緩解期患兒外周血LncRNACASC7、miR-21的表達水平并研究其臨床價值。

1 研究對象與方法

1.1研究對象 選擇2020年6月至2021年10月在襄陽市中心醫(yī)院收治的115例支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒作為急性發(fā)作期組，其中男61例，女54例，年齡(5.8±1.7)歲，根據(jù)支氣管哮喘防治指南[6]將患兒分為輕度組45例，中度組39例，重度組31例。支氣管哮喘緩解期患兒97例作為緩解期組，其中男50例，女47例，年齡(6.2±1.9)歲。納入標準：(1)符合急性發(fā)作期與緩解期支氣管哮喘診斷標準[6]；(2)年齡小于14歲。排除標準:(1)合并肺結(jié)核、支氣管擴張、心源性哮喘等其他呼吸系統(tǒng)疾病患者；(2)呼吸道、肺部以外的其他器官感染；(3)1個月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素或1周內(nèi)使用支氣管擴張劑。另選擇體檢健康兒童(無哮喘史)100例作為健康人對照組，其中男55例，女45例，年齡(5.7±1.8)歲。本研究經(jīng)襄陽市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(No.XY-2020-1729)，患者及家屬知情同意。

1.2主要試劑與儀器 CFX96熒光定量PCR儀、Microfugr 20R高速冷凍離心機(美國Bio-Rad公司)，MR-96A酶聯(lián)免疫檢測儀(武漢科爾達醫(yī)療科技公司)，PA-600免疫比濁儀(深圳普門科技股份有限公司)，肺功能TAED檢測儀(美國通用電氣公司)，NanoDrop OneC型超微量紫外分光光度計(賽默飛世爾科技有限公司)。Trizol試劑(上海碧云天生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTReagent Kit、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(北京全式金公司)，超敏C反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3研究方法

1.3.1標本采集 采集急性發(fā)作期組、緩解期組患兒入院第1天時(健康兒童于體檢當日采集)的空腹外周血10 mL，置于肝素鈉抗凝管中。取5 mL于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清樣本，置于-80 ℃保存。另取5 mL外周血，用于分離單個核細胞，置于-80 ℃保存。

1.3.2RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應 取上述各組的外周血標本，用Trizol試劑提取外周血單個核細胞中的總RNA，采用NanoDrop OneC型超微量紫外分光光度計檢測并收集吸光度(A260 nm/A280 nm)值為1.8～2.0的樣本，將濃度定量為0.5 μg/μL，用于后續(xù)試驗。按照PrimeScriptRTReagent Kit說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，cDNA樣本置于-20 ℃保存。

1.3.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LncRNACASC7、miR-21的表達 采用基于TB Green染料RT-qPCR法檢測血清樣本中LncRNACASC7、miR-21的表達水平，引物序列見表1，并由上海生工生物工程有限公司合成。按照SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR擴增，RT-qPCR反應體系為20 μL，包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH、U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算LncRNACASC7和miR-21相對表達量，公式:ΔΔCt=[(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內(nèi)參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內(nèi)參基因)]。每組設(shè)3個復孔，重復3次。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.4hs-CRP檢測 取外周血2 mL置于EDTA-K2抗凝管中，送至本院檢驗科，按照普門PA-600免疫比濁儀及hs-CRP檢測試劑盒說明書檢測hs-CRP的表達水平，參考區(qū)間：0.68～0.88 mg/L。

1.3.5ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α水平 取凍存的血清樣本200 μL，恢復至室溫，按照TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書進行檢測。通過NanoDrop OneC型超微量紫外分光光度計檢測樣本A450 nm值，并計算樣本濃度。IL-6參考區(qū)間：370～460 ng/L；TNF-α參考區(qū)間：0.74～1.54 ng/mL。

1.3.6肺功能指標檢測 所有研究對象均在呼吸內(nèi)科檢測以下肺功能評價指標，包括第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、最大呼吸峰流速(peak expiratory flow rate，PEF)[8]，測量3次，取其均值。FEV1參考區(qū)間：>4.26 L，F(xiàn)VC參考區(qū)間：>4.13 L，PEF參考區(qū)間：450～600 L/min。

2 結(jié)果

2.13組觀察對象一般資料、炎癥因子及肺功能指標的比較 健康人對照組、緩解期組、急性發(fā)作期組患兒之間的年齡、性別、哮喘家族史比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但血清炎癥因子hs-CRP、TNF-α、IL-6的表達水平依次升高(P<0.05)，而肺功能指標FEV1、FVC、PEF的表達水平依次降低(P<0.05)。與健康人對照組比較，急性發(fā)作期組、緩解期組患兒外周血LncRNACASC7的表達水平降低，而miR-21的表達水平升高(P<0.05)；與緩解期組比較，急性發(fā)作期組患兒外周血LncRNACASC7的表達水平降低，而miR-21的表達水平升高(P<0.05)，見表2。

2.2急性發(fā)作期不同嚴重程度哮喘患兒外周血LncRNACASC7、miR-21表達水平的比較 輕度組、中度組、重度組哮喘患者外周血LncRNACASC7的表達水平依次降低，而miR-21的表達水平依次升高(P<0.05)，見表3。

表3 急性發(fā)作期不同嚴重程度哮喘患兒外周血LncRNA CASC7、miR-21表達水平的比較

2.3支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血LncRNACASC7、miR-21的表達與炎癥因子和肺功能指標的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血LncRNACASC7與miR-21的表達水平呈負相關(guān)性(r=-0.568，P<0.05)。支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血LncRNACASC7與hs-CRP、TNF-α、IL-6水平呈負相關(guān)，而與FEV1、FVC、PEF呈正相關(guān)(P<0.05)；miR-21與hs-CRP、TNF-α、IL-6水平呈正相關(guān)，而與FEV1、FVC、PEF呈負相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血LncRNA CASC7、miR-21的表達與炎癥因子和肺功能指標的相關(guān)性

2.4LncRNACASC7、miR-21對支氣管哮喘急性發(fā)作期、緩解期患兒的鑒別診斷價值 將支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒作為急性發(fā)作期組，緩解期患兒作為緩解期組，繪制ROC曲線。根據(jù)Youden指數(shù)最大原則，明確cut-off值，并計算ROC曲線下面積(AUCROC)、敏感性、特異性，評估LncRNACASC7、miR-21單獨及聯(lián)合檢測對支氣管哮喘急性發(fā)作期的診斷效能。結(jié)果顯示，外周血LncRNACASC7鑒別診斷支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒的AUCROC為0.863(95%CI:0.809～0.906)，當cut-off值為0.76時，其敏感性為78.26%，特異性82.47%。外周血miR-21鑒別診斷支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒的AUCROC為0.922(95%CI:0.877～0.954)，當cut-off值為2.14時，其敏感性為82.61%，特異性為83.51%。二者聯(lián)合檢測的AUCROC為0.955(95%CI:0.918～0.979)，敏感性為89.57%，特異性為88.66%，見圖1。

圖1 LncRNA CASC7、miR-21鑒別診斷支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒的ROC曲線

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，研究證實，促炎癥反應及抑炎癥反應失衡導致氣道處于慢性炎癥狀態(tài)，引發(fā)氣道高反應性而發(fā)生該疾病[9]。hs-CRP、TNF-α、IL-6與支氣管哮喘發(fā)病機制及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，TNF-α還可促進炎癥細胞浸潤，導致肺損傷及肺功能下降，而FEV1、FVC、PEF是反映肺功能的常見指標[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘發(fā)病伴隨炎性因子分泌增加，以及肺功能異常，證實支氣管哮喘發(fā)病與炎癥反應有關(guān)，并且隨著患兒病情加重，肺功能損傷嚴重。

LncRNACASC7能夠加強重癥哮喘患者對激素治療敏感性，其通過調(diào)控miR-98-5p/SIRT3軸，抑制氣道炎癥因子分泌，抑制支氣管平滑肌細胞增殖[11]。另有研究顯示，過表達LncRNACASC7可降低IL-1β、IL-6和TNF-α的水平[12]。本研究顯示，支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血LncRNACASC7表達水平降低，提示LncRNACASC7可能通過調(diào)控炎癥反應，參與急性發(fā)作期哮喘的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。最近有報道發(fā)現(xiàn)[13]，在肺結(jié)核外周血單核細胞中LncRNACASC7表達下調(diào)，且活動性肺結(jié)核組LncRNACASC7高于非活動性肺結(jié)核組。本研究結(jié)果表明，LncRNACASC7的表達水平隨病情加重而降低，且LncRNACASC7與炎癥因子、肺功能指標具有相關(guān)性，提示外周血LncRNACASC7異常表達與病情嚴重程度密切相關(guān)，推測由于LncRNACASC7水平受抑制，導致炎癥加重，最終表現(xiàn)為患兒病情嚴重程度加重。

miR-21在參與支氣管哮喘炎癥反應、氣道重塑等方面發(fā)揮重要作用[14]。尚朋娟等[7]研究顯示，支氣管哮喘患兒血清中miR-21呈高表達，與TNF-α、IL-17、IL-6呈顯著正相關(guān)。本研究中，急性發(fā)作期組患兒外周血miR-21表達水平升高，與先前報道的結(jié)果類似。研究證實，抑制miR-21表達可抑制肺泡M2巨噬細胞的極化，降低TH2嗜酸性氣道炎癥，同時降低氣道反應和氣道重塑過程[15]。本研究顯示，miR-21表達水平隨著病情加重而升高，與鄧穎云等[16]研究結(jié)果一致，且miR-21表達水平與炎癥因子、肺功能指標存在明顯相關(guān)性，筆者推測miR-21與支氣管哮喘疾病發(fā)作期嚴重程度確有關(guān)系，病情越嚴重，其水平越高，分析原因可能是miR-21水平升高通過調(diào)節(jié)促炎細胞因子分泌，加重氣道炎癥，以及細胞周期調(diào)節(jié)、氣道重塑有關(guān)。此外，LncRNACASC7與miR-21表達水平呈負相關(guān)性，提示LncRNA-CASC7可能通過調(diào)控miR-21表達，參與兒童支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展。筆者進一步繪制ROC曲線以評估LncRNACASC7、miR-21對支氣管哮喘急性發(fā)作期的鑒別診斷價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合鑒別診斷的AUCROC可增至0.955。

綜上所述，支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血中LncRNACASC7呈低表達，miR-21呈高表達，且與病情嚴重程度有關(guān)，二者聯(lián)合對支氣管哮喘急性發(fā)作期有一定的鑒別診斷價值。然而，外周血LncRNACASC7、miR-21的表達參與調(diào)控支氣管哮喘的具體調(diào)控機制尚未明確，今后需擴大樣本量，并通過細胞試驗等深入探究。