李偉，吳佩佩，錢暉，許文榮

(江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

外泌體(exosome)是一類直徑約為30～150 nm、起源于內體的脂質雙層囊泡，幾乎來源于所有類型細胞中，并在體液(包括唾液、尿液、血液和母乳等)中大量存在。外泌體所包含的蛋白質/脂質和核酸等內容物是一種新的細胞間通訊分子，外泌體轉運的生物活性分子主要通過以下機制影響靶細胞：通過表面結合的配體直接激活靶細胞；將活化的受體轉移至受體細胞；通過功能蛋白、脂質和RNA的傳遞對受體細胞進行表觀遺傳重編程。另外在免疫系統(tǒng)中，外泌體還可參與抗原呈遞、免疫激活、免疫抑制以及通過外泌體介導的細胞間通迅產生的免疫耐受性等免疫調節(jié)作用。由于外泌體與多種疾病的發(fā)生進展密切相關，外泌體相關的分子標志物檢測在疾病的診斷及療效評估中優(yōu)勢突出。本文旨在對外泌體標志物及其在臨床中的應用研究進行簡要評述。

1 外泌體標志物與腫瘤診斷

外泌體在調控腫瘤細胞的基因突變、無限增殖、血管生成、轉移和免疫逃逸等方面起著重要的作用[1]。外泌體在多種體液中的存在和穩(wěn)定性使其可以作為一種理想的可用于疾病診斷的非創(chuàng)傷性液體活檢指標。循環(huán)體液中外泌體攜帶的與癌癥相關的生物信號分子或將成為癌癥早期檢測和治療的新靶標。

微小RNA(microRNA, miRNA)是非編碼RNA(non-coding RNA)中最為常見的一類非編碼單鏈RNA分子，長度約為19～24個核苷酸。研究顯示，miRNA是腫瘤外泌體檢測中較為常見的標志物，如血液循環(huán)中表達升高的外泌體miR-21被證實與多種腫瘤相關，包括胰腺癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及食管癌等[2]。腫瘤細胞來源外泌體miR-21的高表達可能與其參與的腫瘤血管生成有關。Liu等[3]發(fā)現(xiàn)肺癌細胞釋放的外泌體miR-21可通過轉錄信號轉導子與激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)依賴機制，誘導周圍支氣管細胞血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的產生，從而促進血管生成。Tanaka等[4]研究發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清外泌體miR-21水平顯著高于對照組(P=0.000 9)，其進一步以miR-21中位數(shù)水平作為截斷值，結果發(fā)現(xiàn)，miR-21高表達患者與低表達患者病灶轉移的比例差異亦有統(tǒng)計學意義(30.8% vs 12%，P=0.041)，提示外泌體miR-21不僅具有作為食管癌的診斷潛力，也可以用于判斷疾病發(fā)展程度。除了血液外泌體分析外，尿液外泌體標志物分析也可以用于臨床診斷，如Armstrong等[5]發(fā)現(xiàn)在膀胱癌患者中，尿液miR-21(r=0.88,P<0.001)和miR-4454(r=0.83,P<0.001)的表達水平顯著上調，且證實尿液和腫瘤細胞miRNA的表達水平呈正相關(r=0.42,P<0.001)，提示膀胱癌患者尿液的外泌體具有一定的腫瘤特異性，具有良好的臨床診斷價值。

外泌體蛋白也可作為腫瘤的診斷標志物。如Chen等[6]采用無標記定量蛋白質組學技術分析乳腺癌患者和健康人對照血漿外泌體，結果發(fā)現(xiàn)144種磷蛋白的表達水平顯著升高(FDR<0.05)。提示特定外泌體磷蛋白具有腫瘤特異性，具有作為腫瘤診斷生物學標志物的潛力，但外泌體磷蛋白檢測的進一步臨床應用需要依賴于更多磷蛋白抗體的開發(fā)。作為最為重要的腫瘤相關蛋白質之一，凋亡抑制蛋白(survivin)也可作為腫瘤診斷標志物應用于臨床。Gleichenhagen等[7]采用ELISA法和商業(yè)化試劑盒UBC?Rapid聯(lián)合檢測膀胱癌患者尿液survivin蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)其篩查膀胱癌和健康人對照的ROC曲線下面積(AUCROC)值為0.84，敏感性和特異性分別為66%和95%；篩查高級別膀胱癌和健康人對照的AUCROC值為0.91，敏感性可提升至82%。但survivin的分泌也可能與炎癥發(fā)生相關，如何排除炎癥干擾是survivin用于膀胱癌診斷需要考慮的一個重要因素。目前已報道的可用于臨床診斷的其他外泌體蛋白包括用于肺癌診斷的脂多糖結合蛋白(LBP)[8]、纖維連接蛋白(FN)[9]，用于乳腺癌診斷的重組人SH3-結構域GRB2樣2蛋白(SH3GL2)、線粒體融合蛋白2(MFN2)[10]和用于胃癌診斷的三結構域蛋白3(TRIM3)[11]等。

2 外泌體標志物與神經系統(tǒng)疾病診斷

外泌體已被證實與多種神經退行性疾病的發(fā)展相關，包括阿爾茨海默病(AD)。Fiandaca等[12]檢測57例AD患者和57例健康人對照血液外泌體蛋白的水平差異，發(fā)現(xiàn)AD患者總tau蛋白含量(191±12.3 pg/mL,P<0.001)、P-T181-tau(106±6.1 pg/mL,P<0.000 1)、P-S396-tau(25.4±2.25 pg/mL,P<0.000 1)和Aβ1-42(18.5±2.97 pg/mL,P<0.000 1)均顯著高于健康人對照(分別為130±11.9 pg/mL,16.9±1.89 pg/mL,3.88±0.26 pg/mL和0.83±0.13 pg/mL)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，AD患者確診時的血清P-T181-tau和P-S396-tau水平與AD患病前(1～10年)相比差異無統(tǒng)計學意義，但Aβ1-42水平卻顯著升高，表明Aβ1-42或可提前1～10年預判AD的發(fā)生。

外泌體的miRNA在AD的診斷上也具有一定的應用價值。Lugli等[13]等發(fā)現(xiàn)AD患者血漿外泌體中miR-342-3p(340.63 vs 547.94,t=0.003 9,P<0.05)和miR-23b-3p(285.73 vs 378.79,t=0.022 8,P<0.05)水平均與健康對照人群存在顯著性差異，提示血漿外泌體miR-342-3p和miR-23b-3p的顯著下調具有診斷AD的潛力。在腦脊液外泌體標志物中，Riancho等[14]發(fā)現(xiàn)在18例AD患者和18例對照組腦脊液樣本中，miR-9-5p和miR-598在AD患者中的檢出率均為0%，而在對照組中的檢出率分別為50%(P=0.001)和75%(P<0.001)。提示腦脊液外泌體miRNA在AD診斷中具有潛在的臨床價值，但腦脊液取樣需要進行局部麻醉后行腰椎穿刺，采樣便捷性要低于血樣采集。

Raoof等[15]通過一項大樣本量的回顧性研究，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-27a-3p、miR-328-3p和miR-654-3p篩查遺傳性全面性癲癇(genetic generalized epilepsies，GGE)的AUCROC值分別為0.73,0.72和0.63，而三者聯(lián)合檢測可以提高至0.74。提示miR-27a-3p、miR-328-3p和miR-654-3p聯(lián)合檢測可以作為GGE篩查的潛在標志物。此外，Martins-Ferreira等[16]發(fā)現(xiàn)miR-146a、miR-155和miR-132可能參與了GGE的病理過程，尤其是miR-155在癲癇患者體內顯著升高(P<0.001)，可作為判斷癲癇進展的重要指標。隨著研究的進一步深入，外泌體標志物在癲癇的診斷方面有望得到進一步應用。

3 外泌體標志物與感染性疾病診斷

在病毒和細菌感染的過程中，微生物以及被感染細胞均能產生外泌體，這些外泌體在炎癥反應、免疫調節(jié)、擴散感染、宿主細胞死亡、病原體清除及疾病診斷等方面發(fā)揮著重要的作用。因此，外泌體具有成為多種感染性疾病診斷生物學標志物的潛力。

外泌體參與HBV感染的多個步驟并調控感染后的免疫反應，某些外泌體miRNAs有望成為判斷肝組織炎癥的敏感生物學標志物。例如，李榮華等[17]證實在持續(xù)丙氨酸氨基轉移酶(ALT)正常的HBV患者中，肝組織炎癥分級≥A2和

外泌體標志物在結核病的診斷方面也有一定的進展。Diaz等[20]發(fā)現(xiàn)，結核分枝桿菌(Mtb)感染可導致外泌體蛋白質組分發(fā)生顯著變化，其中有41種蛋白質顯著富集，包括熱休克蛋白90(HSP90), 波形蛋白(vimentin), 冠蛋白1C (coronin 1C)和膜突蛋白(moesin)等，并與膜蛋白呈顯著相關。Lin等[21]分別對肺炎、肺結核和肺癌患者胸腔積液外泌體的miRNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-378i在肺結核患者中的表達水平顯著升高(P<0.01)，提示miR-378i在肺結核診斷中具有較高的應用潛力。

4 外泌標志物與心血管疾病診斷

心血管系統(tǒng)的多種細胞均可產生外泌體，外泌體介導的信號傳導、炎癥反應與凝血等生物學功能在心血管系統(tǒng)的病理生理過程中具有重要的作用。內皮細胞凋亡、炎癥及缺氧狀態(tài)下均可增加外泌體的釋放，釋放的外泌體與促炎、促凝血因子及血栓形成有關，參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[22]。Wang等[23]檢測了65例動脈粥樣硬化患者和68例健康人對照的血漿外泌體中長鏈非編碼(LncRNA)低氧誘導因子1α反義鏈(HIF1 α-antisense RNA1，HIF1A-AS1)的表達差異，發(fā)現(xiàn)患者血漿中HIF1A-AS1顯著高于對照組(P<0.01)，HIF1A-AS1的表達與循環(huán)外泌體水平呈顯著相關性(r=0.875,P<0.001)，ROC曲線分析證實，血漿外泌體和HIF1A-AS1區(qū)分動脈粥樣硬化和健康人對照的AUCROC值分別為0.861和0.823，提示循環(huán)外泌體和HIF1A-AS1檢測具有動脈粥樣硬化的診斷潛力。

Jansen等[24]分析了181例冠心病患者的外泌體miRNA水平，發(fā)現(xiàn)外泌體中高表達miR-126和miR-199-a的患者可以降低心血管事件的發(fā)生率，其風險比(OR)分別為0.485和0.518(P<0.05)，進一步行Kaplan-Meier生存分析，結果顯示高表達miR-126的患者與低表達患者相比，首次心血管事件(major adverse cardiovascular event, MACE)的發(fā)生率顯著下降(P=0.007),miR-126高表達和低表達患者無MACE發(fā)生的8年生存率分別為79.5%和60.2%。提示外泌體miR-126和miR-199-a可以用于預判冠心病患者心血管事件的發(fā)生風險。

5 外泌體與其他系統(tǒng)疾病診斷

除了在上述疾病中的診斷應用外，外泌體作為診斷標志物也在其他類型的疾病上進行了大量的研究。例如在自身免疫性疾病方面，Song等[25]發(fā)現(xiàn)類風濕關節(jié)炎(RA)患者體內外周血單個核細胞來源的外泌體HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA, hotair)水平明顯高于健康人對照，平均升高約4倍(1.6～6.5倍，P<0.001)。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)RA患者和健康人對照滑膜細胞外泌體中LncRNAs存在差異表達，其中LncRNA ENST00000483588上調，而LncRNA ENST00000438399、LncRNA uc004afb.1、LncRNA ENST00000452247下調，其篩查RA和健康人對照的AUCROC分別為0.85、0.92、0.97和0.92。提示這些LnRNAs的失調可能參與RA的病變過程。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡方面，Perez-Hernandez等[27]發(fā)現(xiàn)與健康人對照相比，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者尿液外泌體miR-146a的表達水平顯著上升(1 vs 15，P<0.01)。另外miR-146a鑒別診斷合并活躍期狼瘡腎炎SLE患者和無狼瘡腎炎SLE患者的AUCROC為0.960，當cut-off值為15.3時，其敏感性為100%，特異性90%。提示尿液miR-146a水平可以作為SLE的疾病標志物，同時也具有判定SLE進展程度的潛力。

6 外泌體標志物的檢測技術進展

6.1蛋白質檢測 經典的蛋白質分析方法主要包括ELISA法和western blot，但二者并不適合于外泌體蛋白的檢測，目前檢測方法主要基于抗體、核酸適配體和蛋白質組學相關質譜技術。隨著適配體技術的發(fā)展，需要復雜檢測準備流程的抗體檢測的缺點越來越凸顯。蛋白質組學相關質譜因其龐大的數(shù)據(jù)量以及操作的復雜程度也不適合于將來應用于快速臨床檢測的需求。適配體檢測方法結合了成熟的核酸技術，其作用本質是一段單鏈DNA或者RNA分子折疊形成特定三維結構，并與生物靶標高親和力和高特異性結合。核酸適配體同時具有特異性識別能力和基于PCR/HCR(雜交鏈式反應)的信號放大能力。相對于抗體而言核酸適配體的結合能力較低，有利于外泌體的洗脫，從而可以避免造成對外泌體形態(tài)學和功能分析的影響[28]。因此核酸適配體在外泌體的檢測中將起到越來越重要的作用。

6.2核酸檢測 RNA是外泌體中起到關鍵作用的裝載物，而DNA的含量則相對較少[28]。外泌體純化后，可以采用多種商業(yè)化試劑盒進行RNA的提取和純化。RNA的定量分析可以采用分光光度計通過芯片和軟件操作進行分析。RNA的表達分析則可以通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)或基因芯片(microarray)進行。對于極微量核酸樣本的檢測以及拷貝數(shù)變異狀態(tài)的分析，可以使用微滴式數(shù)字 PCR (droplet digital PCR，ddPCR)進行分析，其靈敏度和精確度均高于 qPCR。二代測序技術(next-generation sequencing)可以分析外泌體中的全轉錄組，有助于發(fā)現(xiàn)新的有效序列。大多數(shù)RNA的檢測方法也可用于外泌體DNA的檢測。

6.3脂質體檢測 細胞水平脂質體的分析已有相對成熟的方法，但由于外泌體中脂質體的功能有限，近年來關于脂質體檢測方法創(chuàng)新的報道少見[28]。已有方法包括薄層色譜法(TLC)、液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、電噴霧電離質譜法(ESI-MS)、氣相色譜電子轟擊質譜法(GC-EI-MS)、液相色譜電噴霧電離串聯(lián)質譜法(LC-ESI-MS/MS)等。

在外泌體的檢測未來發(fā)展上，微流控技術也是一個可能的方向。微流控技術只需要較小的樣本量，可以大大減少檢測的規(guī)模和成本以及操作的復雜度，能夠在較小的空間內同時實現(xiàn)多個樣本的快速檢測。通過實現(xiàn)微流控芯片的免疫捕捉功能，可以將微流控芯片和免疫磁珠兩者的優(yōu)勢結合起來[29]。磁珠-外泌體結合體可以結合一些表征分析技術，比如流式細胞術、電鏡等，從而實現(xiàn)在分離過程中同時檢測，節(jié)約檢測時間。

生物傳感平臺，包括基于表面等離子共振技術(surface plasmon resonance technology, SPR)和表面增強拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)的生物傳感器技術也有報道應用于外泌體的檢測。Fan等[30]建立了 SPR成像生物傳感平臺，該平臺具有3個分別用不同抗體(CD63，EGFR 和 EpCAM)修飾的通道，可用于非小細胞肺癌(NSCLC)衍生的不同亞型的外泌體檢測。Zhang等[31]報道了一種快速靈敏的SERS生物傳感器，同時可以檢測外泌體上的多種蛋白質標記并進一步進行表型分析。

7 小結及展望

外泌體作為細胞間信號轉導的基本方式之一，攜帶有蛋白質、核酸、脂質等大量生物活性物質，且具有穩(wěn)定性好、內容物豐富、無創(chuàng)及檢測迅速的優(yōu)勢，已經在腫瘤、心血管疾病、神經系統(tǒng)疾病等多種疾病的診斷和預后判斷中顯示出巨大的潛力[32]。但目前很多經過初步研究發(fā)現(xiàn)的具有診斷潛力的外泌體標志物仍缺乏大樣本量重復性驗證的臨床確認過程，在臨床上的廣泛應用受到一定的限制。不同體液中的外泌體分離提取方法包括采集、預處理和保存等均影響檢測結果，因此獲取穩(wěn)定均一、易于標準化的體液外泌體提取方法是本領域重要挑戰(zhàn)之一。隨著不同類型疾病發(fā)生、發(fā)展過程中外泌體參與機制的深入研究，高通量篩選技術的發(fā)展，以及針對不同疾病類型標本采集方式的規(guī)范，外泌體標志物將有望進入廣泛的臨床應用階段。