周雨瀟，王成，王靜，張鈺，張春妮，汪俊軍

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京210002)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤前列，早期癥狀缺乏特異性，其診斷主要依賴(lài)于影像學(xué)方法，臨床上缺乏有價(jià)值的血清學(xué)分子標(biāo)志物，患者預(yù)后極差，5年生存期不足15%[1-2]。細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是一類(lèi)由細(xì)胞主動(dòng)分泌或釋放至胞外的膜性小泡，廣泛存在于包括外周血、尿液、乳汁等體液和細(xì)胞培液中，內(nèi)含核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等多種生物活性分子，具備作為多種疾病特別是腫瘤新型液體活檢分子標(biāo)志物的潛能[3-4]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是EVs中含量最為豐富的一類(lèi)非編碼小核酸分子，可來(lái)源于腫瘤細(xì)胞或病變組織分泌，并參與腫瘤微環(huán)境間細(xì)胞通訊、代謝調(diào)控、血管新生和腫瘤生長(zhǎng)等病理過(guò)程，有望在惡性腫瘤的早期篩查中發(fā)揮重要作用[5]。報(bào)道顯示，let-7家族 miRNA在不同物種中十分保守，且腫瘤組織中l(wèi)et-7家族miRNA常呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)并發(fā)揮抑癌作用，與惡性腫瘤特別是NSCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。目前，let-7家族 miRNA中關(guān)于let-7d(包括let-7d-3p和let-7d-5p)價(jià)值的研究報(bào)道較少，且大部分集中于let-7d-5p，外周血特別是EVs中l(wèi)et-7d-3p與NSCLC研究在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道；同時(shí)，與家族其他成員相比，不同腫瘤中l(wèi)et-7d-3p的變化趨勢(shì)及生物學(xué)功能并不一致。為此，本研究針對(duì)NSCLC密切相關(guān)的let-7家族成員let-7d-3p，比較并分析NSCLC患者與健康人對(duì)照EVs中l(wèi)et-7d-3p的表達(dá)水平差異及其臨床應(yīng)用價(jià)值，探討其作為NSCLC非侵入性液體活檢分子標(biāo)志物潛能。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2020年9月至2021年5月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)心胸外科收治并經(jīng)病理組織學(xué)確診的NSCLC患者102例，其中女性54例，男性48例，年齡(59.3±12.9)歲。病理類(lèi)型為腺癌84例，鱗癌16例，未知2例；TNM分期：Ⅰ期65例，Ⅱ期4例，Ⅲ期6例，Ⅳ期21例，未知6例。NSCLC納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均符合國(guó)際肺癌研究學(xué)會(huì)(IASLC)第8版肺癌TNM分期中篩查標(biāo)準(zhǔn)[7]，且經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診；肝腎功能正常；凝血功能正常；初診或初次患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在肺部手術(shù)史；既往接受靶向治療或放化療治療；合并其他惡性腫瘤；存在血液系統(tǒng)疾病。選取同期在本院健康體檢中心體檢各項(xiàng)指標(biāo)正常的健康人70例為健康人對(duì)照組，其中女性34例，男性36例，年齡(56.8±6.3)歲。NSCLC患者組與健康人對(duì)照組間性別(Z=0.563 2，P=0.573 3)、年齡(t=1.501，P=0.135 2)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2020DZGZRZX-022)，各研究對(duì)象知情同意。

1.2儀器及試劑 5418型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，高速低溫組織研磨儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)，TL988-Ⅳ 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(西安天隆科技有限公司)，DW-86L626醫(yī)用低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)。Exosome 提取試劑盒、Trizol試劑(美國(guó) Life Technologies 公司)，酸性水飽和酚(北京索萊寶公司)，分析純級(jí)別氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇(上海國(guó)藥集團(tuán)試劑公司)，人工合成的let-7d-3p成熟體(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)，miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物、qRT-PCR引物序列及TaqMan探針(美國(guó)Life Technologies公司)，逆轉(zhuǎn)錄體系和qRT-PCR體系所用試劑(大連TaKaRa公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 用含分離膠的促凝真空采血管收集患者治療前及健康人對(duì)照禁食12 h以上的靜脈血3～5 mL，血液標(biāo)本采集后迅速在室溫下3 500×g離心10 min，用Eppendorf(EP)管收集上層血清，置于-80 ℃保存。

1.3.2血清EVs分離及RNA提取

1.3.2.1血清EVs分離 將血清標(biāo)本從-80 ℃取出，置于室溫溫育，室溫下2 000×g離心30 min。用全新無(wú)菌無(wú)DNA/RNA酶EP管(2 mL)收集上層血清100 μL。嚴(yán)格按照 EVs分離試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，按標(biāo)本∶試劑比為5∶1(即100 μL血清加入20 μL試劑)的比例將標(biāo)本和試劑充分渦旋混勻，再將二者混合物置于4 ℃冷沉淀30 min。沉淀完畢后于室溫下10 000×g離心10 min。離心后盡量吸棄上層血清，僅保留管底的EVs沉淀。

1.3.2.2血清EVs RNA提取 用Trizol法提取血清EVs RNA，步驟：在提取EVs沉淀后，將2顆磁珠放入裝有EVs沉淀的2 mL EP管中，加入1 mL Trizol 試劑，使用高速低溫組織研磨儀以60 hz/min速度研磨EVs沉淀120 s，室溫靜置10 min。加入200 μL三氯甲烷，立即劇烈震蕩直至混勻，室溫靜置10 min。4 ℃、16 000×g離心20 min，吸取上清液500 μL于新的1.5 mL無(wú)菌除酶EP 管內(nèi)，與等體積異丙醇充分混合，-20 ℃沉淀1 h。4 ℃、16 000×g離心20 min。離心后棄去上清液，用75%乙醇溶液(DEPC水稀釋)洗滌，再次4 ℃、16 000×g離心20 min。棄去上清液，將EP管倒扣至吸水紙上，自然晾干，加入20 μL DEPC水完全溶解RNA 沉淀，置于-80 ℃保存或立即進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EVs miRNA 用基于TaqMan探針的qRT-PCR法檢測(cè)血清EVs中miRNA let-7d-3p(CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU)

的表達(dá)水平。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為10 μL，包括DEPC水3.5 μL，5×AMV緩沖液2.0 μL，10 mmol/L dNTP mixture 1.0 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物1.0 μL，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(5 U/μL)0.5 μL，RNA樣本2.0 μL。反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min；42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min。cDNA樣本凍存于-20 ℃。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括ddH2O 13.77 μL，10×PCR緩沖液2.0 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，10 mmol/L dNTP mixture 0.4 μL，rTaq聚合酶(5 U/μL)0.3 μL，miRNA檢測(cè)探針及引物混合物0.33 μL，cDNA 2.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)Ct值為相應(yīng)樣本重復(fù)測(cè)定3次后所得均值，同時(shí)以不含RNA的模板的ddH2O水作為陰性對(duì)照。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 用基于TaqMan探針的qRT-PCR方法檢測(cè)梯度稀釋的人工合成let-7d-3成熟體。成熟體粉末按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行溶解和稀釋?zhuān)襟E：1 nmol成熟體粉末離心后加入1 mL DEPC水配制成濃度1 μmol/L的母液，取10 μL母液加入990 μL DEPC水配成濃度為10-3μmol/L的RNA溶液，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。倍比稀釋?zhuān)喝? μL逆轉(zhuǎn)錄后cDNA加入9 μL DEPC水配成10-4溶液，從10-4溶液中取1 μL加入9 μL DEPC水配成10-5溶液，從10-5溶液中取1 μL加入9 μL DEPC水配成10-6溶液，從10-6溶液中取1 μL加入9 μL DEPC水配成10-7溶液，從10-7溶液中取1 μL加入9 μL DEPC水配成10-8溶液，得到5個(gè)梯度稀釋液后進(jìn)行qRT-PCR。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程及qRT-PCR總反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件與let-7d-3p檢測(cè)一致并同步進(jìn)行。最后，以成熟體濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以測(cè)得的Ct值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣本EVs let-7d-3p的含量。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析 采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中正態(tài)分布資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)(第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，3組及3組以上比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。miRNA水平與變量間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。采用ROC曲線分析let-7d-3p表達(dá)水平對(duì)NSCLC患者的輔助篩查價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血清EVs中l(wèi)et-7d-3p的表達(dá)水平 qRT-PCR結(jié)果顯示，與健康人對(duì)照組[69.75 (25.64, 154.70)fmol/L]相比，NSCLC患者血清EVs中l(wèi)et-7d-3p的表達(dá)水平[26.09 (13.74, 45.56) fmol/L]明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=1 830,P<0.001)。

2.2不同臨床分期NSCLC患者血清EVs中l(wèi)et-7d-3p的表達(dá)水平 對(duì)患者按國(guó)際肺癌研究學(xué)會(huì)(IASLC)第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。與健康人對(duì)照組血清EVs let-7d-3p水平相比，NSCLC 臨床Ⅰ期、Ⅲ期及Ⅳ期患者水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。NSCLC 臨床Ⅱ期患者與健康人對(duì)照組相比，血清EVs let-7d-3p水平呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且不同分期患者間let-7d-3p水平差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 不同臨床分期NSCLC患者血清EVs let-7d-3p 表達(dá)水平比較

2.3NSCLC患者血清EVs中l(wèi)et-7d-3p的篩查效能分析 運(yùn)用ROC曲線分析血清EVs中l(wèi)et-7d-3p水平區(qū)分NSCLC患者及早期(臨床Ⅰ期)患者的臨床效能，結(jié)果顯示以健康人作為對(duì)照組，EVs中l(wèi)et-7d-3p區(qū)分NSCLC患者的ROC曲線下面積(the area under the ROC curve，AUCROC)為0.744(95%CI：0.667～0.821)，當(dāng)cut-off值為45.07 fmol/L時(shí)，其篩查NSCLC的敏感性和特異性分別為74.5%和60%；同時(shí)，以健康人作為對(duì)照組，EVs中l(wèi)et-7d-3p區(qū)分NSCLC Ⅰ期患者的AUCROC為0.736(95%CI：0.653～0.819)，且當(dāng)cut-off值為45.07 fmol/L時(shí)，其篩查NSCLC Ⅰ期患者的敏感性和特異性分別為75.4%和60%。

2.4不同臨床因素對(duì)血清EVs中l(wèi)et-7d-3p的水平影響分析 對(duì)患者不同年齡(≥ 60歲 vs <60歲)、性別(男性vs女性)、吸煙史(有vs無(wú))及病理類(lèi)型(腺癌vs 鱗癌)組別間血清EVs中l(wèi)et-7d-3p的水平差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示不同年齡、性別、是否存在吸煙史和病理類(lèi)型組別間let-7d-3p的水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U值分別為1 160,1 137，976和658，P值分別為0.349，0.287，0.489和0.898)，見(jiàn)表2。

表2 不同臨床因素對(duì)NSCLC患者血清EVs let-7d-3p 表達(dá)水平的影響

3 討論

目前臨床上缺乏有價(jià)值的NSCLC血清學(xué)標(biāo)志物，早期篩查困難。本研究針對(duì)NSCLC患者血清EVs中l(wèi)et-7d-3p的表達(dá)變化及價(jià)值開(kāi)展研究，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者特別是早期(臨床Ⅰ期)患者血清EVs中l(wèi)et-7d-3p水平與健康人對(duì)照相比顯著降低，具備作為NSCLC輔助篩查液體活檢分子標(biāo)志物潛能；同時(shí)，ROC曲線結(jié)果表明，EVs中l(wèi)et-7d-3p水平測(cè)定還可作為NSCLC早期輔助篩查分子標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清EVs中l(wèi)et-7d-3p的水平呈現(xiàn)明顯降低趨勢(shì)，與既往報(bào)道的let-7d-3p在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中變化及發(fā)揮抑癌miRNA作用較為一致。Goldstraw 等[7]發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌患者血清let-7d-3p的水平顯著降低，具備作為卵巢癌潛在的標(biāo)志物。Nascimento等[8]發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血清let-7d-3p的水平也顯著降低，具備作為宮頸癌新的分子標(biāo)志物。但let-7d-3p在組織中變化與外周血中并不完全一致[9]。García-Vázquez等[10]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中l(wèi)et-7d-3p的表達(dá)水平與癌旁組織相比呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)，且患者腫瘤組織中l(wèi)et-7d-3p水平與卡鉑/紫杉醇化療療效呈顯著正相關(guān)。Turashvili等[11]發(fā)現(xiàn)let-7d-3p在三陰乳腺癌患者中也呈現(xiàn)高表達(dá)，且高表達(dá)let-7d-3p與患者總生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率明顯相關(guān)，表明let-7d-3p可能與腫瘤患者療效及預(yù)后密切相關(guān)，且外周血let-7d-3p的表達(dá)變化與有組織中呈現(xiàn)出不同特征，EVs則可能是外周血和組織變化不一致的潛在原因。

本研究結(jié)果顯示，let-7d-3p在NSCLC患者血清EVs中的表達(dá)顯著降低，但在不同吸煙史、鱗癌和腺癌患者間的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。目前，關(guān)于let-7d-3p在肺癌中的變化報(bào)道較為有限。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，let-7d-3p在NNK誘導(dǎo)的肺癌模型小鼠和NNK刺激的小鼠肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，且甘草查爾酮A治療可逆轉(zhuǎn)由NNK誘導(dǎo)的變化，提示let-7d-3p參與了NNK誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生過(guò)程，并具備作為肺癌治療潛在的靶點(diǎn)。Zhang等[13]通過(guò)生物信息學(xué)分析法和公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)let-7d-3p在肺癌患者中的表達(dá)升高，且let-7d-3p水平高表達(dá)的肺鱗癌患者預(yù)后更差。本研究與上述研究不一致的原因既可能是因?yàn)橥庵苎徒M織/細(xì)胞樣本類(lèi)型差異引起，也可能是本研究納入的NSCLC鱗癌患者較少導(dǎo)致，后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大樣本量，深入驗(yàn)證癌組織和外周血以及肺腺癌和肺鱗癌患者EVs let-7d-3p的表達(dá)特征及差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，let-7d-3p在早期NSCLC患者血清中即呈現(xiàn)顯著降低，具備作為NSCLC早期輔助篩查標(biāo)志物潛能。目前，關(guān)于EVs中l(wèi)et-7d-3p的研究才剛起步，腫瘤患者EVs中l(wèi)et-7d-3p的表達(dá)及價(jià)值研究?jī)H見(jiàn)1篇報(bào)道。例如Zheng等[14]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血漿外泌體(Evs的一種亞類(lèi))中l(wèi)et-7d-3p的表達(dá)與對(duì)照相比顯著降低，具備作為宮頸癌患者非侵入性液體活檢分子標(biāo)志物潛能。因此，后續(xù)應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大腫瘤樣本類(lèi)型及數(shù)量，進(jìn)一步探討EVs let-7d-3p在其他腫瘤中的變化。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究所納入的樣本量仍較少，樣本來(lái)源也較為單一，后續(xù)應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，從多中心角度深入探討其對(duì)于NSCLC患者價(jià)值；其次，本研究未比較肺部良性疾病如良性結(jié)節(jié)、肺部炎癥患者血清EVs中l(wèi)et-7d-3p水平，其對(duì)于NSCLC的篩查及鑒別診斷價(jià)值仍有待進(jìn)一步研究；最后， let-7d-3p在NSCLC組織、細(xì)胞系及細(xì)胞培液中是否與血清EVs存在一致的變化尚不清楚， EVs let-7d-3p參與NSCLC的功能亦需在后續(xù)研究闡釋。

綜上所述，本研究針對(duì)let-7d-3p這一研究較少的miRNA，從血清EVs角度探討了NSCLC患者血清EVs中l(wèi)et-7d-3p的變化及價(jià)值，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者與健康人對(duì)照相比，患者血清EVs中l(wèi)et-7d-3p水平顯著降低，且NSCLC Ⅰ期患者血清EVs中l(wèi)et-7d-3p水平亦顯著降低，具備作為NSCLC患者輔助篩查液體活檢分子標(biāo)志物潛能。