王榕，王成,，陳陽，丁小宇，張春妮，張辰宇，汪俊軍

(1.南京醫(yī)科大學(xué)金陵臨床醫(yī)院&東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京210002；2. 南京大學(xué)生命科學(xué)院，南京210046)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是一種起源于腎小管上皮的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國RCC年發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)分別為77 410 人和 46 345人[2]。目前臨床上仍缺乏特異性分子診斷和篩查標(biāo)志物，因此尋找具有潛在臨床應(yīng)用前景的RCC分子標(biāo)志物顯得尤為迫切。微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，在RCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。人外周血循環(huán)中存在豐富、穩(wěn)定表達(dá)的miRNA，可作為潛在的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物[4]。循環(huán)miRNA還可被包裹于細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)并被攜載進(jìn)入受體細(xì)胞，發(fā)揮重要的生理、病理功能。miR-135b-5p轉(zhuǎn)錄本位于人類 1q32.1位點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物中高度保守。Nagel等[5]于2008年首次發(fā)現(xiàn)miR-135b在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)。迄今，大量研究證實(shí)其可通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)胰腺癌[6]和胃癌[7]等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，提示miR-135b具有作為惡性腫瘤分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)潛能，但miR-135b-5p在RCC患者血清、細(xì)胞系及細(xì)胞分泌的EVs中的表達(dá)變化和臨床價(jià)值尚不清楚；同時(shí)，RCC患者血清中miR-135b-5p是否參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展亦不明確。因此，本研究通過進(jìn)一步檢測RCC患者血清中miR-135b-5p表達(dá)水平變化，并開展系列體外細(xì)胞試驗(yàn)，初步探討其參與RCC的作用機(jī)制，明確RCC患者血清中miR-135b-5p水平變化、臨床應(yīng)用價(jià)值及作用機(jī)制，以期為RCC診治提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1血清標(biāo)本來源 收集2022年1月至6月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院泌尿外科初收的RCC患者60例，男性44例，女性16例，年齡(56.45±9.81)歲。所有患者均經(jīng)病理活檢確診且未經(jīng)過治療，排除腎囊腫、腎良性腫瘤及其他腎臟疾病。確診的RCC患者中腎透明細(xì)胞癌45例，腎嗜酸性細(xì)胞腺癌5例，腎乳頭狀細(xì)胞癌4例，嫌色細(xì)胞癌4例和基因融合相關(guān)性腎細(xì)胞癌2例。另收集同期體檢健康者60例，男性42例，女性18例，年齡(46.10±15.47)歲。

1.1.2細(xì)胞系來源 人源正常腎小管上皮細(xì)胞系HK-2、人源腎腺癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、人源透明細(xì)胞癌細(xì)胞系Caki-1均購自美國模式培養(yǎng)集存庫(American type culture collection，ATCC)；HUVEC購自上海瑾原生物科技有限公司。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑(美國Life Technologies公司)，氯仿、異丙醇、無水乙醇(上海國藥集團(tuán)試劑公司)，酸性酚(北京索萊寶公司)，3 mol/L(pH=5.5)醋酸鈉(美國Thermo Fisher Scientific公司)， exoEasy Maxi Kit(德國Qiagen公司)， DEPC水、RIPA裂解液(上海Beyotime公司)，qRT-PCR引物及TaqMan探針(美國ABI公司)，qRT-PCR體系試劑(大連TaKaRa公司)，DMEM、McCoy′s5A培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Corning公司)，鼠抗血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)單克隆抗體、羊抗鼠二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，miRNA NC和mimics(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)。418型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，TL988-Ⅳ 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(西安天隆科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)上清EVs提取 當(dāng)1.1.2中各細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，PBS洗滌2次，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集16 mL培養(yǎng)上清，按照exoEasy Maki Kit提取試劑盒說明書操作，從細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離EVs后重懸于400 μL XE Buffer中待用。

1.3.2細(xì)胞與細(xì)胞EVs總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。取重懸于400 μL XE Buffer的細(xì)胞EVs，待細(xì)胞提前培養(yǎng)至融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用預(yù)冷PBS洗滌2次，分別加入1.0 mL Trizol試劑和200 μL氯仿，后續(xù)按照Trizol試劑說明書提取，RNA沉淀溶于20 μL DEPC水，用全波長酶標(biāo)儀測定濃度和純度并用DEPC水稀釋至0.5 μg/μL，隨即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，cDNA樣本置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3血清總RNA提取 血清RNA提取采用本課題組前期建立的苯酚—氯仿一步法[8]，提取的RNA沉淀溶于20 μL DEPC水，并置于-80 ℃保存。

1.3.4miRNA水平檢測 細(xì)胞、細(xì)胞EVs和血清miRNA水平檢測采用基于TaqMan探針的qRT-PCR法進(jìn)行，具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)參照本課題組前期研究[8]進(jìn)行。血清、細(xì)胞及EVs miRNA水平測定均以miR-16為內(nèi)參照，細(xì)胞和細(xì)胞EVs miRNA表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計(jì)算，公式：ΔCt=CtmiR-135b-5p-CtmiR-16，ΔΔCt=CtACHN/Caki-1-CtHK-2，血清miRNA表達(dá)水平以2-ΔCt法計(jì)算，公式：ΔCt=CtmiR-135b-5p-CtmiR-16。 每個(gè)Ct值為相應(yīng)樣本重復(fù)測定3次后所得均值，同時(shí)以不含RNA的模板的ddH2O水作為陰性對(duì)照。

1.3.5RCC細(xì)胞分泌的EVs與HUVEC共培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至融合度達(dá)80%時(shí)，每孔2 mL培養(yǎng)基中加入100 μL RCC EVs，與HUVEC共培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.6miRNA的過表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待生長至融合度達(dá)80%～90%時(shí)，隨機(jī)分成兩組，分別轉(zhuǎn)染無義對(duì)照序列(NC組)和miRNA模擬劑(miR135b-5p-mimics組)，按照Lipofectamine 3 000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，每孔轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L，轉(zhuǎn)染劑量為每孔250 μL，轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h，即可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.7Western blot檢測 取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，細(xì)胞裂解液充分裂解，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清，按照BCA試劑盒說明書操作測定蛋白質(zhì)濃度。若蛋白質(zhì)濃度相差過大，需要將蛋白質(zhì)濃度調(diào)平。將調(diào)整后樣品加入loading buffer煮沸10 min，分裝備用。步驟如下，電泳：配制125 g/L PAGE凝膠，加入蛋白質(zhì)樣品10 μg，maker 5 μL，80 V濃縮，120 V分離。轉(zhuǎn)膜：PVDF膜浸泡于甲醛1 min，按照黑色版—纖維墊—濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙—纖維墊—白板依次放置夾緊，在電泳槽的快速轉(zhuǎn)膜液中400 mA轉(zhuǎn)膜40 min。封閉：在快速封閉液中室溫?fù)u床封閉1 h，PBST洗膜4次，每次10 min?？贵w溫育：加入ANGPTL4鼠單克隆抗體(稀釋度1∶3 000)和α-Tubulin鼠單克隆抗體(稀釋度1∶5 000)，4 ℃溫育過夜，PBST洗膜后加入IgG二抗(TBST稀釋1∶5 000)室溫溫育2 h，PBST洗膜4次，每次10 min。曝光：ECL發(fā)光A液與B液1∶1混合，均勻滴加在PVDF膜上，置于化學(xué)發(fā)光成像儀中進(jìn)行曝光。結(jié)果使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.3.8HUVEC成環(huán)試驗(yàn) 提前在4 ℃下預(yù)冷24孔板、200 μL槍頭及基質(zhì)膠，在24孔板中用基質(zhì)膠布孔后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min使其凝固，期間將預(yù)處理的HUVEC用2.5 g/L胰蛋白酶消化離心并重懸，用牛鮑式計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)約10萬個(gè)細(xì)胞，置于提前凝固的基質(zhì)膠中，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h時(shí)分別拍照5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中HUVEC形成的閉環(huán)個(gè)數(shù)。

1.3.9miR-135b-5p的生物信息學(xué)預(yù)測 運(yùn)用Targetscan軟件預(yù)測和分析miR-135b-5p靶基因，進(jìn)一步運(yùn)用RNAhybrid軟件預(yù)測miRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)及自由能，若折疊自由能<-20.0 kcal/mol[9]，則提示miRNA對(duì)靶基因具有較強(qiáng)的結(jié)合與調(diào)控作用。

2 結(jié)果

2.1RCC患者血清miR-135b-5p的表達(dá)水平 qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-135b-5p在RCC患者血清中的表達(dá)水平[6.932(5.524，9.964)]較健康人對(duì)照組[5.534(4.373，6.555)]明顯升高，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=1 042，P<0.01)。

2.2ROC曲線分析 結(jié)果顯示，血清miR-135b-5p能夠很好地區(qū)分健康人對(duì)照和RCC患者，ROC曲線下面積(AUCROC)為0.711(95%CI：0.619 ～ 0.802)，當(dāng)cut-off值為6.67時(shí)，miR-135b-5p篩查RCC的敏感性和特異性分別為55%和78.3%(圖1)。

圖1 血清miR-135b-5p對(duì)RCC篩查的ROC曲線

2.3RCC細(xì)胞和細(xì)胞分泌EVs中miR-135b-5p的表達(dá)水平 qRT-PCR結(jié)果顯示，ACHN和Caki-1細(xì)胞中miR-135b-5p的表達(dá)水平較正常HK-2細(xì)胞明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別升高了7.821倍和1.919倍，P值分別為0.000 3和0.000 1)；ACHN和Caki-1 EVs中miR-135b-5p的表達(dá)水平較HK-2 EVs亦顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別升高了3.783倍和2.627倍，P值分別為0.000 1和0.000 4)。

2.4RCC細(xì)胞分泌的富含miR-135b-5p EVs可促進(jìn)HUVEC成環(huán) 成環(huán)試驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，RCC細(xì)胞分泌的富含miR-135b-5p EVs在不同時(shí)間點(diǎn)(4 h 、6 h和8 h)均可明顯促進(jìn)HUVEC成環(huán)能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.011 2，0.005 7，0.001 7)。見圖2。

注：*，P<0.05。

2.5生物信息學(xué)分析 應(yīng)用RNAhybrid軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p在ANGPTL4的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)處具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。其最小自由能為-23.1 kcal/mol，種子序列區(qū)域內(nèi)有10個(gè)堿基完全互補(bǔ)配對(duì)。見圖3。

圖3 miR-135b-5p與候選靶基因的mRNA 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)及自由能

2.6miR-135b-5p對(duì)ANGPTL4蛋白表達(dá)的影響 HUVEC經(jīng)miR-135b-5p過表達(dá)后，qRT-PCR檢測證實(shí)，mimics組細(xì)胞分泌的EVs中 miR-135b-5p的表達(dá)水平(139.50±17.12)顯著高于NC組(0.137±0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.05，P=0.000 1)。進(jìn)一步運(yùn)用Western blot檢測HUVEC中ANGPTL4蛋白表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)mimics組ANGPTL4蛋白的表達(dá)水平為(0.616±0.003)，較NC組(1.00±0.05)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.44，P=0.000 2)。見圖4。

圖4 HUVEC過表達(dá)miR-135b-5p對(duì)ANGPTL4蛋白表達(dá)的影響

2.7miR-135b-5p對(duì)血管形成的影響 成環(huán)試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-135b-5p mimics組與NC組相比，在2 h、4 h、6 h、8 h時(shí)的成環(huán)數(shù)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.000 1，0.000 1，0.003 2，0.009 5)。見圖5。

注：*，P<0.05。

2.8年齡、性別對(duì)血清miR-135b-5p的水平影響分析 為探討年齡、性別是否影響miR-135b-5p的水平，對(duì)不同年齡(≥46.1歲vs<46.1歲)、性別(男性vs女性)健康人對(duì)照者組別間血清miR-135b-5p的水平差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示不同年齡[5.579(4.081，6.394) vs 5.489(4.681，7.030)]、性別[5.534(4.386，6.359) vs 5.687(4.191，9.996)]組別間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.371 1，0.456 7)。

3 討論

血清miRNAs對(duì)于RCC臨床診斷和預(yù)后具有潛在價(jià)值。報(bào)道顯示，與健康人對(duì)照相比，腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)患者血清中miR-122-5p和miR-206的表達(dá)水平顯著降低。此外，高miR-122-5p和miR-206血清水平與ccRCC患者的無進(jìn)展期、癌癥特異性和總生存期較短相關(guān)[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，5種血清miRNA組合包括miR-193a-3p、miR-362、miR-572、miR-28-5p和miR-378對(duì)RCC的早期篩查具有一定的價(jià)值[8]。此外，miR-196a-5p在較高 Fuhrman分級(jí)的RCC患者血清中顯著下調(diào)；血清miR-429的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，且患者血清miR-429 水平與常規(guī)治療后的臨床結(jié)果之間存在相關(guān)性[11]。本研究結(jié)果顯示，RCC患者血清中miR-135b-5p的表達(dá)水平顯著高于健康人對(duì)照者，結(jié)合ROC曲線分析提示其具有作為RCC非侵入性分子輔助篩查標(biāo)志物的潛能；進(jìn)一步體外細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RCC細(xì)胞系及細(xì)胞分泌EVs中miR-135b-5p的表達(dá)水平較對(duì)照組細(xì)胞及細(xì)胞分泌EVs亦顯著升高，且表達(dá)變化趨勢(shì)一致，說明RCC可以分泌含miR-135b-5p的EVs進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)血管成環(huán)，參與RCC發(fā)生、發(fā)展。

既往研究已證實(shí)，miR-135b-5p可參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p 在胰腺癌組織和細(xì)胞系中的上調(diào)表達(dá)，且通過靶向NR3C2促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT。人胃癌(GC)組織中miR-135b-5p的表達(dá)上調(diào)，且通過靶向 Krüppel樣因子4(KLF4)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的活力、增殖、遷移和侵襲[13]。相反，在惡性黑色素瘤(MM)組織和細(xì)胞中，miR-135b-5p的表達(dá)水平下降，上調(diào)miR-135b-5p表達(dá)可引起RBX1蛋白下調(diào)，顯著抑制MM細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b-5p在兩種RCC細(xì)胞系以及兩種RCC細(xì)胞分泌EVs中均顯著升高，提示miR-135b-5p也可能參與RCC的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步研究miR-135b-5p參與RCC的分子機(jī)制后，筆者發(fā)現(xiàn)RCC細(xì)胞分泌富含miR-135b-5p EVs可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的成環(huán)作用。此外，通過文獻(xiàn)調(diào)研和生物信息學(xué)分析，證實(shí)ANGPTL4是其重要靶點(diǎn)之一。qRT-PCR檢測證實(shí)，過表達(dá)miR-135b-5p后的HUVEC細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞分泌EVs中miR-135b-5p的表達(dá)水平顯著升高。Western blot結(jié)果顯示ANGPTL4蛋白的表達(dá)顯著降低，且miR-135b-5p的過表達(dá)可使HUVEC成環(huán)作用增加，再次說明ANGPTL4是RCC進(jìn)展中的關(guān)鍵靶蛋白，miR-135b-5p可進(jìn)入HUVEC中發(fā)揮作用。目前，關(guān)于腫瘤患者血清中miR-135b-5p的表達(dá)變化和關(guān)于其他腎臟疾病(包括腎囊腫)血清中miR-135b-5p表達(dá)變化的報(bào)道尚缺乏。故而本研究針對(duì)RCC血清中miR-135b-5p表達(dá)變化進(jìn)行研究，并深入研究其參與RCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。

血管生成是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵病理過程。ANGPTL4是血管生成素家族一員，由C端纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域和1個(gè)N端卷曲螺旋片段構(gòu)成。既往研究表明，ANGPTL4在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮了促血管生成作用[15]。2013年，一項(xiàng)研究通過使用HUVEC進(jìn)行血管形成測定發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ANGPTL4的腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基抑制了HUVEC的血管形成，并且評(píng)估血管形成的所有參數(shù)均被顯著抑制，表明腫瘤來源的ANGPTL4的大部分抗血管生成活性是通過抑制腫瘤微環(huán)境中的血管形成來介導(dǎo)的[16]。綜合以上研究證實(shí)，對(duì)于ANGPTL4的促血管生成和抗血管生成作用還存在許多爭議，究其原因猜測可能與不同腫瘤組織及各自的腫瘤微環(huán)境等密切相關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)ANGPTL4在轉(zhuǎn)染miR-135b-5p的HUVEC中的表達(dá)明顯下降，血管形成明顯增加，說明miR-135b-5p的過表達(dá)可以抑制ANGPTL4的表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成。

本研究存在一定的局限性。首先血清miR-135b-5p檢測的樣本量偏少，缺乏良性疾病對(duì)照，且為單中心研究，后續(xù)研究中應(yīng)加大樣本量、多中心研究繼續(xù)驗(yàn)證，并深入研究RCC血清EVs miR-135b-5p表達(dá)變化。其次，本實(shí)驗(yàn)對(duì)潛在靶基因的驗(yàn)證較為缺乏，后續(xù)將采用螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證； 最后，ANGPTL4作為miR-135b-5p的靶基因，參與RCC進(jìn)展中血管形成的具體分子機(jī)制還需深入探究。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p在RCC患者血清中的表達(dá)水平升高，提示血清miR-135b-5p水平可作為RCC患者潛在的臨床輔助分子篩查標(biāo)志物。同時(shí)，體外細(xì)胞水平驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-135b-5p在ACHN和Caki-1 RCC細(xì)胞系以及細(xì)胞分泌的EVs中表達(dá)水平顯著升高。生物信息學(xué)分析結(jié)果表示，ANGPTL4作為miR-135b-5p的靶基因之一，參與了RCC發(fā)生、發(fā)展過程中的血管形成，對(duì)臨床RCC的靶向分子治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。