張曉娟，李雅紅，張燕, 孫云，蔣濤

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心,南京 210004)

18-三體(trisomy 18，T18)，又稱愛德華綜合征(Edwards syndrome，ES)，是僅次于21-三體的最常見的染色體異常之一，發(fā)病率為1/8 500～1/3 600，其臨床表現(xiàn)多變，可累及多個器官和系統(tǒng)，患者存在顱面畸形、心臟畸形、智力低下和發(fā)育遲緩等[1]。雖然18-三體在上世紀(jì)60年代即被發(fā)現(xiàn)，但其具體病理機制仍未完全闡明，有待深入探索[2]。

近年來，代謝組學(xué)在疾病的發(fā)生機制、早期標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、疾病診斷、疾病預(yù)后和治療等方面已有較多應(yīng)用[3-4]。羊水中含有羊膜上皮細胞、胎兒組織和胎盤組織產(chǎn)生的大量代謝物，可以反映胎兒發(fā)育過程中的生理病理狀況[5]。因此，進行18-三體妊娠母體羊水的非靶向代謝組學(xué)研究具有重要意義。本研究基于氣相色譜飛行時間質(zhì)譜(gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF/MS)的非靶向代謝組學(xué)方法探索18-三體妊娠母體羊水中代謝物的變化并尋找差異代謝物，以期為18-三體妊娠的病理機制研究提供新思路。

1 研究對象與方法

1.1研究對象 采用病例-對照研究，收集2012年1月至2013年12月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心行胎兒染色體芯片分析確診為18-三體的單胎妊娠母體羊水樣本8例作為病例組，收集同期因血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險或高齡行胎兒染色體芯片分析的單胎妊娠母體羊水樣本40例為對照組。所有參與研究的孕婦均來自江蘇省，具有相同的種族背景，并排除妊娠期相關(guān)并發(fā)癥，如高血壓和糖尿病等。病例組排除18-三體以外的其他致病性染色體異常；對照組排除致病性染色體異常以及結(jié)構(gòu)畸形，如先天性心臟病、開放性神經(jīng)管畸形、唇腭裂、神經(jīng)系統(tǒng)畸形和泌尿系統(tǒng)畸形等，出生后隨訪無異常。病例組男/女胎兒性別比為1∶7，孕婦年齡(28.28±2.85)歲，采樣孕周為19～26周，中位孕周22.5周；對照組男/女胎兒性別比為18∶22，孕婦年齡(28.28±2.85)歲，采樣孕周為20～24周，中位孕周21周。兩組間胎兒性別組成(χ2=2.944，P=0.123)和孕婦年齡(t=0.020，P=0.984)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。然而，受臨床因素影響，難以收集到孕周完全匹配的樣本，兩組間孕周差異存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.218，P=0.027)。所有樣本均置于-20 ℃保存。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)[寧婦倫字(2018)91號]，免除知情同意。

1.2試劑和儀器 Pegasus HT氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)聯(lián)儀(美國Leco公司)，真空離心濃縮儀和低溫冷凍干燥機(美國Labconco公司)，Rxi-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Restek公司)，超純水(由配備LC-MS Pak過濾器的Mill-Q Reference系統(tǒng)產(chǎn)生，美國Millipore公司)，自動進樣玻璃瓶(美國Agilent公司)。[N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)，體積比99∶1]、甲醇、二氯甲烷、乙腈、氯仿、己烷和丙酮(美國Thermo-Fisher公司)，脂肪酸甲酯(C7-C30, FAMEs)標(biāo)準(zhǔn)品、甲氧基胺鹽酸鹽、無水硫酸鈉和吡啶(美國Sigma公司)。

1.3樣本檢測 樣本制備、質(zhì)譜條件和質(zhì)譜檢測方法參照本課題組前期實驗方法進行[6]。

1.3.1樣本制備 羊水樣本冰浴下緩慢解凍，4 ℃、3 000×g離心3 min；取100 μL上清置于預(yù)冷的EP管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)液，輕微混勻后再加入200 μL預(yù)冷的甲醇∶氯仿(3∶1，v/v)混合溶液，混勻后4 ℃、14 000×g離心20 min;取200 μL上清至1.5 mL的自動進樣瓶，置于真空離心濃縮儀中旋干5 min后轉(zhuǎn)移至低溫冷凍干燥機完全凍干；恢復(fù)室溫后充入高純氮氣保護，自動壓蓋保存。置于自動衍生平臺XploreMET 進行硅烷化衍生，步驟：加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，30 ℃溫育2 h，加入50 μL MSTFA(含保留指數(shù)FAMEs)，37.5 ℃溫育1 h。衍生好的樣本由進樣臂自動進樣。

1.3.2GC-TOF-MS檢測 步驟：載氣為氦氣(99.999 9%)，進樣量為1 μL，流速恒定1.0 mL/min；GC溫度編程設(shè)定:在80 ℃下等溫加熱2 min，以12 ℃/min的速率升溫至300 ℃(4.5 min)，再以40 ℃/min的速率升至320 ℃，維持1 min；前進樣口及傳輸線溫度均設(shè)定為270 ℃。MS檢測具體設(shè)置：電子轟擊電離(-70 eV)；離子源溫度為220 ℃；探測器電壓為-1 450 V；采集速率為25 spectra/s；檢測質(zhì)量范圍為50～500 m/z。

1.4數(shù)據(jù)及統(tǒng)計學(xué)分析 GC-TOF/MS生成的原始數(shù)據(jù)由XploreMET 3.0軟件處理，包括自動基線去除、平滑、峰識別和解卷積、質(zhì)量控制、矯正，然后將保留指數(shù)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與JiaLib代謝物數(shù)據(jù)庫進行比對，并進行物質(zhì)鑒定[7]。采用開源分析軟件MetaboAnalyst 5.0進行峰面積歸一化和正態(tài)轉(zhuǎn)化，建立主成分分析(Principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal partial least square discri mination analysis，OPLS-DA)模型。使用SPSS 22.0軟件進行Mann-WhitneyU檢驗、Student′st檢驗和邏輯回歸分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1多維分析結(jié)果 無監(jiān)督的PCA模型分析表明，病例組與對照組之間無明顯分離趨勢(圖1A)。有監(jiān)督的OPLS-DA模型(圖1B)觀察到兩組之間的分離趨勢(R2Y=0.878，Q2=0.038)，然而，這種分離趨勢是因模型過擬合引起，模型置換檢驗顯示P=0.065。PCA和OPLS-DA模型均證實病例組與對照組之間的代謝譜差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

注：A，無監(jiān)督PCA模型；B，有監(jiān)督OPLS-DA模型。

2.218-三體差異代謝物 經(jīng)邏輯回歸校正孕周和胎兒性別，病例組和對照組間共發(fā)現(xiàn)5種差異代謝物，分別為甘油醛、葡萄糖酸、硫酸吲哚酚、磷酸鹽和泛酸，且這些代謝物在病例組中顯著增加(表1)。

表1 病例組與對照組羊水差異代謝物及其變化趨勢

3 討論

18-三體是常見的染色體異常疾病，病變累及幾乎所有器官和系統(tǒng)，但其病理機制尚未完全闡明。本研究應(yīng)用非靶向代謝組學(xué)方法探究18-三體妊娠代謝譜的差異，以期尋找差異代謝物。結(jié)果表明，采用PCA和OPLS-DA模型證實18-三體妊娠羊水樣本與正常對照樣本總體代謝譜間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。然而，甘油醛、葡萄糖酸、硫酸吲哚酚、磷酸鹽和泛酸在病例組中的表達水平顯著增加。

甘油醛是糖類代謝的中間產(chǎn)物，在高血糖狀態(tài)下參與甘油醛衍生的晚期糖基化終產(chǎn)物的形成，引起血管炎癥和內(nèi)皮功能障礙，并在包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的發(fā)病機制中起著重要作用[8]。葡萄糖酸是葡萄糖的氧化產(chǎn)物，與氧化應(yīng)激有關(guān)，亦可能與高血糖所致的細胞毒性腦損傷有關(guān)[9]。18-三體胎兒所表現(xiàn)出的全身性器官累及可能與高甘油醛所致的血管炎癥和內(nèi)皮功能障礙有關(guān)，同時患兒的認(rèn)知障礙可能與葡萄糖酸相關(guān)的細胞毒性腦損傷有關(guān)。然而，甘油醛和葡萄糖酸與18-三體相關(guān)的研究鮮見報道。

磷酸鹽穩(wěn)態(tài)對機體至關(guān)重要，其在多種生物過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，高濃度的磷酸鹽是腎臟和心血管疾病的危險因素，可導(dǎo)致心臟重構(gòu)[10]。Sun等[11]的研究表明，硫酸吲哚酚的積累會破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致小鼠焦慮、抑郁和認(rèn)知障礙。已知18-三體患者常存在心臟畸形和認(rèn)知障礙，而磷酸鹽和硫酸吲哚酚水平增加與心血管疾病相關(guān)，且硫酸吲哚酚對神經(jīng)系統(tǒng)有一定損害，因此，推測磷酸鹽和硫酸吲哚酚水平的增加可能在18-三體的病理機制中發(fā)揮一定的作用。泛酸即維生素B5，是輔酶A合成的必需水溶性微量元素，而輔酶 A 是 TCA 循環(huán)和脂肪酸代謝的關(guān)鍵輔助因子[12]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)泛酸與18-三體之間的相關(guān)報道。

本研究存在以下不足之處：首先，病例組樣本數(shù)量相對較少，且缺少大量樣本驗證；其次，未對差異代謝物進行相關(guān)功能研究。在后續(xù)的研究中，筆者將對找出的差異代謝物進行驗證，并對驗證的差異代謝物進行相關(guān)功能研究。 綜上所述，本研究通過非靶向代謝組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)18-三體胎兒母體羊水中存在多種代謝物的變化，為18-三體病例機制的研究提供了更多研究思路。