彭晴，邱陳玲，貢繼堯，鄭培明，李世寶，徐銀海

( 1.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221000；2．徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州 221000；3.河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 463599)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。胃癌發(fā)病隱匿，早期不易察覺，確診時(shí)往往已是晚期，而晚期胃癌患者的5年生存率不足25%[1]。目前胃鏡檢查與病理活檢仍是診斷胃癌的主要方法，但由于其侵入性，患者耐受性較差[2]。傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖類抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)、糖類抗原72-4(carbohydrate antigen72-4，CA72-4)等在胃癌的臨床診斷中均存在敏感性或特異性較低等缺陷。因此，尋找一種理想的腫瘤標(biāo)志物用于胃癌診斷、監(jiān)測(cè)預(yù)后以及尋找藥物治療的靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。近年來，越來越多證據(jù)表明,胃癌中存在大量差異表達(dá)的circRNA，其廣泛參與胃癌發(fā)生、發(fā)展過程[3]。本課題組前期研究[4]通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，circRNA_0085135在胃癌細(xì)胞系(MKN-45、MGC-803和HGC-27)中的表達(dá)量均顯著高于正常胃上皮細(xì)胞系。本研究擬運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)胃癌患者血清circRNA_0085135的表達(dá)水平，分析其與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，評(píng)估其對(duì)胃癌的臨床診斷效能。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2022年1月至10月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科就診的62例胃癌患者的血清樣本，其中男性50例，女性12例，年齡(64.9±11.7)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)病理組織活檢證實(shí)為原發(fā)性胃癌；(2)未經(jīng)手術(shù)、放療、化療等治療；(3)臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他部位腫瘤；(2)患有嚴(yán)重精神疾病者；(3)患有嚴(yán)重心、肺、腎、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病。臨床分期: 按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版指南[5]和國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南標(biāo)準(zhǔn)分期[6]分為T1/T2期27例，T3 /T4 期 35例;腫瘤大小:≥5 cm 38例，<5 cm 24例;存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例;存在神經(jīng)侵犯 17例，無神經(jīng)侵犯 45 例;分化程度:高分化 7例，中、低分化 55例;腫瘤標(biāo)志物(CEA、CA19-9、CA125、CA72-4) 升高:是18例，否44例。收集同期于消化內(nèi)科就診的胃部良性疾病(主要為慢性胃炎)患者血清樣本50例，其中男性18例，女性32例，年齡 (56.8±13.2)歲，患者均經(jīng)內(nèi)鏡檢查及臨床確診；另外收集體檢中心體檢健康者血清標(biāo)本50例，其中男性25例，女性25例，年齡 (50.9±8.8)歲。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：XYFY2022-KL368-01)，各研究對(duì)象均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 Trizol試劑(美國ABI公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(武漢賽維爾生物科技公司)。Mastercycler nexus gradient梯度PCR儀(德國Eppendorf公司)，LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，OneDropTMOD-1000+超微量分光光度計(jì)(南京五義科技公司)。

1.3標(biāo)本采集 使用含有分離膠的促凝采血管采集各研究對(duì)象治療前(體檢者于體檢時(shí)采集)的空腹靜脈血5 mL，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至無核酶的EP管中，樣本置于-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照Trizol試劑說明書提取血清總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA的純度，選取吸光度(A260 nm/A280 nm)在1.8～2.0的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，標(biāo)本置于-20 ℃保存。

1.5引物設(shè)計(jì)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 根據(jù)circBase數(shù)據(jù)庫(http://www.circbase.org)登錄的circRNA_0085135和內(nèi)參GAPDH基因的序列號(hào)(分別為NM_002568和NM_002046)，用Oligo7引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并由武漢賽維爾生物科技公司合成。circRNA_0085135上游引物序列:5′-TACAAGCCCACCAAGCTAAAGA-3′,下游引物序列:5′-ATGACTCGTGGAACCTGTGAAG-3′，退火溫度為59.7 ℃，產(chǎn)物片段大小為166 bp。GAPDH基因上游引物序列:5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，下游引物序列:5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′，退火溫度為62.4 ℃，產(chǎn)物片段大小為168 bp。PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括:2×SYBR Green Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；用儀器配套的LightCycler?96分析軟件于72～95 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)，并分析數(shù)據(jù)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔， circRNA_0085135的相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計(jì)算。公式:ΔΔCt=[(實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因)-(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)]。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPadPrism 8.0與SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖。偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，多組間比較采用獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(kruskal-wallisH檢驗(yàn))，組間兩兩比較采用dunn檢驗(yàn)。計(jì)量資料以例數(shù)(n)和率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以體檢健康者和胃部良性疾病患者作為對(duì)照組，胃癌患者為疾病組，繪制ROC曲線并評(píng)估血清circRNA_0085135在胃癌中的臨床診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1circRNA_0085135在各組中的表達(dá)水平 血清circRNA_0085135在胃癌組中的相對(duì)表達(dá)量為24.96(10.51,41.45)，顯著高于胃部良性疾病組的6.13(0.23,17.82)和健康人對(duì)照組的0.79(0.18，5.83),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=61.79，P<0.000 1)。 采用Bonferroni法校正顯著性水平后進(jìn)行組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，胃癌組和胃部良性疾病組(χ2=40.792，P<0.000 1)，胃癌組和健康人對(duì)照組(χ2=69.212，P<0.000 1)，胃部良性疾病組和健康人對(duì)照組(χ2=28.420，P=0.007)之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2血清cirRNA_0085135的表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 以胃癌患者血清circRNA_008135相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)(24.96)為分界點(diǎn)，將胃癌患者組其分為高表達(dá)組 (31例) 和低表達(dá)組(31例)，分析血清circRNA_0085135與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，高表達(dá)組與低表達(dá)組的TNM分期、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但年齡、性別、神經(jīng)侵犯、分化程度、腫瘤標(biāo)志物升高之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 血清circRNA_0085135的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.3血清circRNA_0085135診斷胃癌的臨床效能 血清circRNA_0085135診斷胃癌的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.812 6(95%CI：0.745 8～0.879 4，P<0.000 1)，當(dāng)cut-off值為6.390時(shí)，敏感性為87.1%，特異性為64.0%，見圖1。

圖1 血清circRNA_0085135用于胃癌診斷的ROC曲線

3 討論

本研究通過RT-qPCR檢測(cè)證實(shí)，血清circRNA_0085135在胃癌患者血清標(biāo)本中的表達(dá)水平與胃部良性疾病組和健康人對(duì)照組之間均存在顯著差異，提示其可能作為致癌基因在胃癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮一定的作用。此外，筆者通過分析血清circRNA_0085135的表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清circRNA_0085135水平與胃癌患者TNM分期、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)。在診斷效能方面，Yu等[7]研究表明，與癌旁組織相比，胃癌組織中 hsa_circ_0067582的表達(dá)水平明顯降低， hsa_circ_0067582診斷胃癌的AUCROC為0.6937，敏感性為66.67%，特異性為61.29%。而本次實(shí)驗(yàn)以胃部良性疾病+體檢健康者為對(duì)照組，以胃癌為疾病組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其敏感性為87.1%，特異性為64.0%，表明circRNA_0085135有望作為胃癌潛在的診斷標(biāo)志物。

本研究仍有一些不足之處。首先，本研究收集的樣本數(shù)量有限，需要收集更多的樣本以評(píng)價(jià)血清circRNA_0085135的診斷效能。其次，在分析血清circRNA_0085135與胃癌患者臨床病理參數(shù)時(shí)，收集的臨床數(shù)據(jù)不完善，且由于收集的為2022年就診患者的血清樣本，無法獲得足夠的預(yù)后資料及隨訪信息，今后需收集更詳細(xì)、更全面的數(shù)據(jù)用于分析。后續(xù)筆者將增加樣本量，同時(shí)收集患者隨訪資料，進(jìn)行預(yù)后及生存資料分析，并通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證circRNA_0085135潛在的靶基因以及可能參與的信號(hào)通路，同時(shí)進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以探究其在胃癌中的發(fā)病機(jī)制。